PCR技術的開發
- 聚合酶鍊式反應 (聚合酶鍊式反應) 是一種用於擴增特定 DNA 片段的分子生物學技術.
- 它可以認為是在生物體以外發生的特殊類型的DNA複製.
- DNA聚合酶I最初是在 1955.
- E的klenow碎片. 大腸桿菌, 1970年代初發現. h. 克洛諾, 具有實驗價值和實用性.
- 然而, 這種酶在高溫下不耐熱和剝落, 使其不適合在需要高溫變性的PCR中使用.
- 今天常用的酶, 稱為 Taq聚合酶, 從細菌中分離出來 1976.
- 它的耐熱特徵使其成為理想的酶, 但是它的廣泛使用是在1980年代之後.
- PCR的原始概念, 類似於基因修復複製, 是由博士提出的. Kjell Kleppe in 1971.
- 他發表了純基因複制的第一個實驗 (類似於PCR的前兩個週期).
- 今天開發的PCR是由博士開發的. 凱里b. 穆爾斯進來 1983, 當穆里斯在公司PE工作時, 在PCR領域為公司提供特殊位置.
- Mullis和Saiki正式發表了第一本相關論文 1985.
- 自那以後, PCR的應用已迅速擴展, 相關論文的質量超過了許多其他研究方法.
- 隨後, PCR技術已被廣泛用於生物學研究和臨床應用, 成為分子生物學研究的關鍵技術.
- 穆里斯被授予諾貝爾化學獎 1993 為他的貢獻.
PCR原理
PCR技術的基本原理類似於DNA的自然複製過程, 它的特異性取決於與目標序列互補的寡核苷酸引物. PCR由三個基本反應步驟組成: 變性, 退火, 和擴展:
- 模板DNA的變性: 將模板DNA加熱到93°C左右後一段時間後, 模板DNA的雙鏈DNA或由PCR擴增形成的雙鏈DNA分解, 使其單鏈，以便它可以與底漆結合併為下一輪反應做準備.
- 退火 (重新關聯) 模板DNA和底漆: 在將模板DNA變性為單鏈之後, 溫度降至55°C左右, 以及引物的互補序列和單鏈模板DNA對並結合.
- 引物的擴展: 與TAQ DNA聚合酶的作用, 使用DNTP作為反應底物和目標序列作為模板, 根據互補基搭配和半保守複製的原則, 合成了與模板DNA鏈互補的新的半保守複製鏈合成. 該鏈可以擴增成數百萬個目標基因的副本 2 到 3 重複變性小時, 退火, 和擴展過程.
PCR反應系統和反應條件標準PCR反應系統
| 成分 | 體積/濃度 |
|---|---|
| 10X擴增緩衝液 | 10微升 |
| 4 DNTP混合物的類型 | 200微升 |
| 引子 | 10-100微升 |
| 模板DNA | 0.1-2微克 |
| Taq DNA聚合酶 | 2.5微升 |
| mg2+ | 1.5mmol / l |
| 雙蒸餾水 | 100微升 |
PCR反應的五個元素:
- 引子 (PCR引物是DNA片段, 而細胞DNA複製的引物是RNA鏈)
- 酵素
- dNTP
- 模板
- 緩衝液 (需要mg2+)
標準PCR過程包括三個步驟:
- DNA的變性 (90°C-96°C): 在熱量的影響下, 雙鏈DNA模板中斷中的氫鍵斷裂, 形成單鏈DNA.
- 退火 (25°C-65°C): 系統溫度降低, 允許引物與DNA模板結合, 形成本地雙鏈區域.
- 擴大 (70°C-75°C): 用TAQ聚合酶的作用 (最佳活性在72°C附近), 使用DNTP作為底物, 擴展是從5發生的′ 結束3′ 底漆的末端, 合成與模板互補的DNA鏈.
筆記:
- 每個週期都會發生變性, 退火, 和擴展, 加倍DNA量.
- 一些PCR協議, 由於放大區域短, 即使TAQ聚合酶活性不是最佳的，也可以完成複制.
- 在這些情況下, 可以使用兩步方法, 在60°C和65°C之間的溫度下同時進行退火和延伸, 減少溫度週期的數量，從而提高反應速度.
PCR反應特徵
強大的特異性
PCR反應的特異性由:
- 引物與模板DNA的特定和正確結合.
- 基礎配對原則.
- TAQ DNA聚合酶合成反應的忠誠.
- 靶基因的特異性和保守性.
筆記:
- 底漆與模板的正確結合至關重要.
- 引物與模板的結合和底漆鏈的擴展遵循鹼基配對的原理.
- 聚合酶合成反應的保真度和TAQ DNA聚合酶的耐熱性允許退火 (重新關聯) 模板和底漆的發生在較高的溫度下, 大大提高結合的特異性並維持放大靶基因段的高準確性.
- 另外, 通過選擇具有高特異性和保護的目標基因區域, 特異性水平進一步提高.
高靈敏度
- PCR產品的量呈指數增加, 啟用啟動模板的擴增來自皮克圖 (pg = 10^-12) 到微克 (μg= 10^-6).
- 它可以檢測到一百萬個單元的目標細胞.
- 在病毒檢測中, PCR靈敏度可以達到 3 RFU (重組成型單元), 在細菌學中, 最小檢測率為 3 細菌.
簡單快捷
- PCR反應使用耐熱TAQ DNA聚合酶.
- 一旦準備了反應混合物, 變性, 退火, 並在DNA擴增液體和水浴上進行延伸反應, 通常在 2 到 4 小時.
- 擴增產物通常通過電泳分析, 無需使用同位素, 從而最大程度地減少放射性污染並促進傳播.
標本的純度要求低
- 無需分離病毒，細菌或培養細胞; 原油DNA和RNA可以用作擴增模板.
- 臨床標本，例如血液, 體液, 痰, 頭髮, 細胞, 活組織可直接用於DNA擴增檢測.
PCR故障排除
假否定
PCR反應中缺乏擴增帶通常是由關鍵因素引起的:
模板核酸製備
- 污染物，例如模板中的蛋白質, TAQ聚合酶抑製劑的存在, 蛋白質的不完全去除 (特別是組蛋白) 來自染色體DNA, 模板提取期間過多損失, 或苯酚吸入可能有助於該問題.
- 模板核酸的不完全變性也可能起作用.
- 當酶和底漆質量很好時, 而且放大樂隊不會出現, 這可能是由於樣品消化問題或模板核酸提取過程中的故障.
- 應準備有效穩定的消化解決方案, 並且該程序應保持固定.
酶失活
這可能需要用新酶代替酶，或者使用舊酶的組合來分析酶活性損失或不足會導致虛假負面的酶. 有時, 忘記添加TAQ聚合酶或溴化乙錠也可能引起問題.
底漆問題
- 底漆的質量和濃度, 引物濃度的對稱性, 引物合成質量的批處理變化可能會影響PCR結果.
- 解決方案包括選擇著名的底漆合成單元, 通過瓊脂糖凝膠電泳確認底漆濃度, 確保兩個引物的類似頻帶強度, 將底漆以高濃度的小要素存儲以防止降解, 並確保理性底漆設計以防止諸如底漆二聚體形成之類的問題.
Mg2+濃度
MG2+離子濃度顯著影響PCR擴增效率. 過度或不足的濃度會影響特異性或產量, 導致放大失敗.
反應體積變化
PCR容量通常從20μl到100μl, 取決於目的. 應仔細調整量的變化量以防止故障.
身體因素
變性至關重要, 變性不足或退火溫度可能會導致虛假負面因素. 使用標準溫度計檢查熱環生或水浴溫度可以幫助防止故障.
目標序列變化
目標序列中的突變或缺失會影響引物 - 板板的結合, 導致放大失敗.
誤報
觀察到的PCR擴增帶匹配目標序列帶, 有時看起來更均勻，更明亮. 可能的原因:
不適當的底漆設計:
選擇具有非目標序列同源的放大序列可能導致PCR期間非特異性擴增產物. 短目標序列或引物可以導致誤報. 重新設計底漆是必要的.
目標序列或擴增產物的交叉污染:
污染原因:
- 整個基因組或大段的污染可能導致誤報.
- 空氣中小核酸碎片的污染也會引起假陽性.
如何處理這種情況
1. 嚴格的實驗室實踐:
- 謹慎處理樣品，以防止將目標序列吸入到移液管中或濺出離心管外管.
- 高壓滅菌所有試劑和設備, 除了不耐受的酶和材料.
- 使用一次性離心管和移液器尖端來最大程度地減少污染.
2. 紫外線暴露:
- 在添加樣品之前，將反應管和試劑暴露於紫外線，以破壞現有的核酸.
- 引物設計考慮:
- 仔細設計底漆，以最大程度地減少與非目標序列的交叉反應性的潛力.
- 嵌套的PCR方法:
- 實施嵌套的PCR方法，以減輕或消除空氣中小核酸碎片污染引起的假陽性.
非特異性擴增帶的出現
- PCR擴增後, 樂隊的尺寸與預期的樂隊不一致, 更大或更小, 或特定和非特異性頻段同時出現.
- 出現非特異帶的原因是:
- 引物和目標序列之間的不完全互補性, 或底漆二聚體形成.
- MG2+離子濃度過高, 退火溫度太低, 和PCR週期數量過多.
- 酶的質量和數量, 從某些來源易於到非特異性帶的酶, 而其他人不是.
- 過量的酶數量有時會導致非特異性擴增.
- 對策包括:
- 必要時重新設計底漆.
- 減少酶數量或從不同來源切換到酶.
- 降低引物濃度, 適當增加模板濃度, 並減少週期的數量.
- 適當提高退火溫度或採用兩個溫度的方法 (93°C的變性, 在65°C左右退火和延伸).
塗抹或條紋帶的外觀
PCR擴增有時會導致塗抹或條紋帶.
- 這通常是由酶數量過多或酶質量差引起的, 高DNTP濃度, MG2+濃度過高, 低退火溫度, 或週期數量過多.
- 對策包括:
- 減少酶數量或從不同來源切換到酶.
- DNTP濃度降低.
- 適當降低MG2+濃度.
- 增加模板數量.
- 減少週期數.
