背景
草莓是薔薇科多年生草本植物。 (薔薇科) 和草莓屬 (草莓屬). 它們的質地多汁, 營養豐富, 廣泛栽培, 可以新鮮食用或加工. 草莓是重要的經濟作物.
病毒檢測是防治病毒病、培育脫毒苗木的關鍵步驟. 現在, 目前還沒有有效的方法來治療植物病毒性疾病. 一旦田間的植物感染了病毒, 它終生都會受到感染並且無法治愈. 所以, 病毒檢測對草莓產業可持續發展發揮重要作用.
介紹
有超過 30 據報導可以感染草莓的病毒. 常見的包括草莓靜脈帶病毒 (SVBV), 草莓斑駁病毒 (諒解備忘錄), 草莓皺紋病毒 (超臨界電壓), 和草莓輕度黃邊病毒 (斯米耶夫). 我國SCV檢出率較低. 檢測技術的不斷升級和種植面積的擴大導致草莓中新病毒株和類型的發現. 草莓蒼白病相關病毒 (帕瓦病毒) 發現於澳大利亞, 歐洲, 和美國.
使用單個病毒一次僅對一種病毒執行特定檢測 聚合酶鍊式反應 測試耗時且需要大量材料. 所以, 建立可同時檢測多種病毒的多重PCR檢測方法很重要.
多重 PCR 涉及在一個引物中添加多對引物 PCR反應 放大多個模板, 允許同時檢測多種病毒. 與單一 PCR 相比，多重 PCR 更高效、更經濟. 由於引物之間的相互作用，建立穩定的多重 PCR 反應系統具有挑戰性, 競爭性放大, 以及不同模板的最佳擴增條件不同. 需要仔細選擇和優化特異性引物, 反應條件, 和反應系統. 多重 PCR 不是單一 PCR 的簡單混合; 引物的設計是決定多重擴增成功與否的關鍵因素, 為了有效的凝膠電泳區分，多個條帶的大小需要存在差異.
總RNA提取:
為了 提取總RNA 來自草莓葉, SEON生物科技 RNA萃取試劑盒 被使用, 按照提供的說明進行操作.
反轉錄:
逆轉錄過程涉及使用 Takara 的 M-MuLV 逆轉錄酶 (中國) 合成cDNA.
反應體系包括:
- 核糖核酸: 2 微升
- 5× M-MuLV 緩衝器 (普羅麥格): 4 微升
- dNTP 混合物 (2.5 毫摩爾): 1 微升
- 隨機引物 (10 微摩爾): 0.5 微升
- 寡核苷酸 (dT)18 引子 (10 微摩爾): 0.5 微升
- M-MuLV 逆轉錄酶和 RNase 抑製劑各: 0.5 微升
- 無RNase水來補充系統 20 微升
- 徹底混合後, 將溶液短暫離心，然後在 37°C 下孵育 1 小時, 然後在-20°C下儲存.
基於 NCBI 的 SVBV 基因序列信息, 諒解備忘錄, 斯米耶夫, 帕瓦病毒, 病毒-1, 和BrYV, 從 GenBank 獲得，登錄號為 FM867860.1, AJ311876.1, D12517.1, MN747002.1, MW795715, 和ON060762, 分別, 使用 PrimerPremier 識別保守區域 6.0 用於引物設計. 引物長度範圍為 18 到 25 BP, GC 含量介於 40% 和 60%.
分析
設計並篩選多對SVBV引物, 諒解備忘錄, 斯米耶夫, 帕瓦病毒, 病毒-1, 和BrYV. 最初, 所有組合的引物濃度設定為 0.125 微摩爾/公升. PCR擴增程序與單次PCR一致. 篩選後, 鑑定出能夠同時檢測六種病毒的引物組合.
當所有六種引物的濃度均設定為 0.125 微摩爾/公升, SVBV 條帶清晰, SMYEV 波段最寬、最亮, SPaV 譜帶非常明亮, 而SMoV, 布呂夫, StrV-1 條帶較弱. 通過調整 SMoV 的底漆用量, 布呂夫, 和 StrV-1，同時減少 SMYEV 和 SPaV 的量, 確定了合適的引物比例: SVBV:諒解備忘錄:斯米耶夫:帕瓦病毒:布呂夫: StrV-1 = 5:10:2:3:10:10.
結論
在多重 PCR 中, 優化退火溫度, 退火時間, 延伸溫度, 延長時間可以減少引物之間的相互干擾. 在這項研究中, 退火時間 (30-45 s) 和延伸溫度 (68-72℃) 對多重反應的影響最小. 然而, 退火溫度 (50-60℃) 和延長時間 (75-120 s) 對於建立的反應體系至關重要. 退火溫度過高可能導致某些病毒擴增失敗, 可能與引物退火溫度和引物模板結合的穩定性有關. 延伸時間過短和過長都不利於六種病毒同時擴增, 影響產物產量並增加非特異性擴增的可能性. 本實驗建立的多重PCR可鑑定SVBV, 諒解備忘錄, 斯米耶夫, 帕瓦病毒, 病毒-1, 和 BrYV 在一次反應中, 節省檢測成本和時間.
