肝脂肪酶 (HL) 活性測定試劑盒
筆記: 測試前取兩個或三個不同的樣本進行預測.
操作設備: 分光光度計
目錄號: BC2380
尺寸:50T/24S
成分:
試劑一: 100 毫升×1. 4℃保存.
試劑二: 3 毫升×1. 4℃保存.
試劑三: 粉末×1. 4℃保存. 使用前, 添加 30 毫升蒸餾水, 完全溶解.
試劑四: 粉末×2. -20℃保存. 使用前, 添加 2 毫升蒸餾水到一個, 完全溶解. 溶解的試劑可以存儲在 -20 重新包裝後°C. 避免重複凍融週期;
標準: 粉末×1. 使用前, 6.94 ml 丙酮 添加以準備 10 μmol/mLα-萘酚
標準溶液, 使用前完全溶解.
產品描述:
肝脂肪酶 (HL) 是在肝實質細胞中合成的脂解酶. 它存在於肝臟正弦內皮細胞的表面和正弦空間中肝細胞微絨毛的表面, 並可以水解各種脂蛋白. 甘油三酸酯 (TG) 和磷脂 (pl) 在培養基中，各種脂蛋白顆粒的大小和密度改變. 當HL及其在血漿中的活性增加時, 它可能導致低密度脂蛋白 (LDL) 血漿中的水平, 增加和加速動脈粥樣硬化的發生和發展.
HL水解α-萘基乙酸苯甲酸鹽產生α-萘酚, 它可以與快速藍色B鹽形成紫色的偶氮化合物. 它具有特徵性吸收峰 595 奈米, 並且其顏色深度與一定範圍內的肝酯酶活性呈正相關.
需要但未提供的試劑和設備:
分光光度計, 水浴, 平衡, 離心機, 可調節的轉移板, 1 毫升玻璃比色皿, 研缽/均質器, 超聲波破碎機, 冰和蒸餾水.
程式:
我. 酵素 萃取
- 組織
根據組織質量 (G): 試劑的體積i (毫升) 是 1:5〜10提取. 建議添加 1 毫升試劑i至 0.1 克組織, 並在冰浴上完全勻漿. 從10000克離心 10 4℃分鐘去除不溶物, 並在測試前將上清液放在冰上.
- 細菌或細胞
根據細菌或細胞 (104): 試劑的體積i (毫升) 是500~1000:1. 建議添加 1 毫升試劑i至 5 百萬個細菌或細胞. 使用超聲化來分裂細菌和細胞 (置於冰上, 超聲波300W, 工作時間3秒, 間隔7秒, 總時間 3 分分鐘). 離心機在, 10000克為 10 4分鐘在4℃去除不溶性材料並在測試前將上清液取冰.
- 培養基或其他液體: 直接檢測.
二. 偵測
- 預熱分光光度計 30 分分鐘, 調整波長至 595 奈米, 用蒸餾水調零.
- 30℃的預熱試劑III超過 20 分分鐘.
- 標準: 將10μmol/ml標準溶液稀釋至 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078μmol/ml與試劑I.
- 將下列試劑加入 1.5 mL EP 管:
| 對比管 (C) | 試管 (時間) | 標準管 (S) | 空白管 (乙) | |
| 樣本 (微升) | 100 | 100 | – | – |
| 標準溶液 (微升) | – | – | 100 | – |
| 試劑一 (微升) | 450 | 400 | 400 | 500 |
| 試劑二 (微升) | – | 50 | 50 | 50 |
| 混合併做出反應 10 我的30℃ | – | – | ||
| 試劑三 (微升) | 400 | 400 | 400 | 400 |
| 試劑四 (微升) | 50 | 50 | 50 | 50 |
| 徹底混合併檢測到吸光度 595 奈米, 記錄為AC, 在, 和AB分別. ΔAT=(AT-AC), ΔAS=(AS-AB). 每個試管都需要一個對比管, 而且標準曲線只需測試一次或兩次. | ||||
三、. 計算:
1.標準曲線
標準溶液作為X軸的濃度, ΔAs為y軸, 獲得方程y = kx+b. 將ΔAT到等式獲取x (微摩爾/毫升) 價值.
2. 計算
- 組織蛋白濃度
單位定義: 一個單位的酶活性定義為催化α-萘基水解產生的酶的量 1 每分鐘40°時反應系統中每毫克的α-萘酚的μmolμmolμmol.
HL活性 (U/毫克蛋白質)= x×vs÷（××CPR）÷t = 0.1x÷cpr
- 組織重量
單位定義: 一個單位的酶活性定義為催化α-萘基水解產生的量的酶 1 每分鐘40°時反應系統中每克組織的α-萘酚的μmolμmol.
HL活性 (單位/克重量) = x×vs÷(w×vs÷ve)÷t = 0.0333x÷w
- 液體
單位定義: 一個單位的酶活性定義為催化α-萘基水解產生的酶的量 1 每分鐘40°時反應系統中每毫升液體樣品的α-萘酚的μmolμmol.
HL活性 (單位/毫升) = x×vs÷vs÷t = 0.1x
- 細菌或培養細胞
單位定義: 一個單位的酶活性定義為催化α-萘基水解產生的酶的量 1 μmol的α-萘醇 104 每分鐘40°時反應系統中的細胞或細菌.
HL活性 (U/104單元) = x×ve÷單元; t = 0.1x÷單元量
VS: 樣品量 (毫升), 0.1 毫升; 維: 萃取液體積, 1 毫升;
心肺復甦: 上清液樣品蛋白濃度 (毫克/毫升); 時間: 反應時間 (分分鐘), 10 分分鐘;
瓦: 樣品重量, G;
細胞數量: 10 千作為單位.
筆記:
- 如果樣品是動物肝, 建議用試劑I稀釋樣品比 25 測試前的時間, 並在計算中乘以稀釋係數
- 如果樣品是肥胖動物的血清或血漿, 建議用試劑I稀釋樣品比 5 測試前的時間, 並在計算中乘以稀釋係數
- 當ΔA大於 0.8, 建議用試劑稀釋樣品後測量樣品, 並將其乘以計算中的稀釋因子
實驗範例:
- 1G大鼠肝臟進行樣品處理, 和上清液被稀釋 24 次, 然後根據操作步驟進行操作. 測量和計算 96 孔板: ΔA= at-ab = 0.713-0.001 = 0.712, 和標準曲線: y = 0.6381x – 0.0005, 計算x = 1.1166
HL活性 (U/克質量) = x×vs÷ (w×vs÷vst)÷t×48 = 53.597 U/克質量.
- 火雞血清被稀釋後 6 次, 該操作是根據操作步驟進行的. 測量和計算 96 孔板: ΔA= at-ab = 0.572-0.003 = 0.569, 和標準曲線: y = 0.6381x – 0.0005, 計算x = 892
HL活性 (U/克質量) = x×vs÷ (w×vs÷vst)÷t×12 = 1.071 U/克質量
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