Solarbio甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh) 活性測定試劑盒

3-磷酸​​​​甘油醛脫氫酶(gapdh) 活性測定試劑盒

筆記: 測試前取兩個或三個不同的樣本進行預測.

檢測儀器: 分光光度計

目錄號: BC2210

尺寸: 25T/24 ; 50T/48S

成分:

萃取液: 60 毫升×1. 4℃保存.

試劑一: 粉末×1. -20℃保存.

試劑二: 50 毫升×1. 4℃保存.

試劑三: 30 微升×1. 4℃保存. 液體放在試劑瓶中的EP管中. 根據試劑III的劑量和體積比: 蒸餾水 3:100, 攪拌均勻, 立即使用並準備.

產品描述:

gapdh (歐共體 1.2.1.12) 催化3-磷酸甘油醛的氧化至1,3-二磷酸甘油三酸酯. 這是糖酵解途徑的關鍵酶. 它與糖異生密切相關, 血糖濃度的維持和糖尿病的發生. 它在葡萄糖的疾病中起重要作用, 脂質和蛋白質代謝.

3-磷酸甘油酸激酶可以催化三磷酸和ATP的1,3-二磷酸酯的產生. GAPDH反向催化3-磷酸甘油醛的形成, 1,3-二磷酸甘油三酸酯和NADH的無機磷和NAD+. 在 340 NM可以反映GAPDH的活性.

所需的材料

桌子離心, 紫外分光光度計, 恆溫水浴, 砂漿/均化器, 1 ML石英比色卷, 轉讓者, 冰和蒸餾水.

程式:

我. 樣本 萃取:

1. 組織樣本:

根據組織的質量 (G): 萃取液的體積 (毫升) 是 1: 5〜10. 建議 0.1 g 組織 1 萃取液毫升數. 完全在冰上磨, 離心機在 8000 g和4℃ 20 分分鐘. 上清液放在冰上進行測試.

2. 細菌或細胞:

根據細胞的數量 (104): 萃取液的體積 (毫升) 是 500 ～ 1000: 1. 推薦 5 有百萬 1 毫升提取溶液. 使用超聲處理分裂細菌或細胞 (力量 20% 或200W, 工作時間3s, 間隔10秒, 重複 30 次). 離心機在, 8000 g和4℃ 10 分分鐘. 上清液放在冰上進行測試.

3. 血清 (電漿): 直接測量.

二. 決心 程式:

• 預熱紫外分光光度計 30 分分鐘, 調整波長為340 nm, 用蒸餾水調零.
• 準備解決方案: 將所有試劑II倒入一瓶試劑I. 完全溶解. 預熱一定數量的37℃ (哺乳動物) 或25℃ (其他物種) 為了 10 根據需要最小. 未使用的試劑應在sub充電後儲存在-20℃. 避免反覆冷凍和解凍.
• 加入如下清單的試劑:

試劑名稱 (微升)	試管 (時間)	空白管 (乙)
樣本	30
蒸餾水		30
試劑三	20	20
工作溶液	950	950
將上述試劑加入 1 分別毫升石英比色皿. 充分混合. 測量吸光度值A1 AT 340 NM 10秒. 快速將其放入37℃的水浴或孵化器中 (哺乳動物) 或25℃ (其他物種) 為了 5 分分鐘. 取出並迅速乾燥. 測量5min10s的吸光度值A2. 計算ΔAT= A1T- A2T, ΔAB= A1b- A2B, ΔA=ΔAT – ΔAB. 空白管只需要測試1-2次.

三、. 計算:

由微石英比色杯計算

• 通過蛋白質濃度計算:

單位定義: 一個酶活性的單位定義為酶消耗的量 1 每分鐘反應系統中NADH的NMOL, 每個MG蛋白.

GAPDH活動 (U/毫克蛋白質) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS×CPR)÷t = 1072×ΔA÷CPR

• 通過樣品重量計算

單位定義: 一個酶活性的單位定義為酶消耗的量 1 每分鐘反應系統中NADH的NMOL, 每個G樣本.

GAPDH活動 (U/g鮮重) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS×W÷VST)÷t = 1072×ΔA÷w

• 通過細菌或細胞量計算:

單位定義: 一個酶活性的單位定義為酶消耗的量 1 每分鐘反應系統中NADH的NMOL, 每一個 104 細菌或細胞.

GAPDH活動 (U/104細胞) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS×500÷VST)÷t = 2.14×ΔA

• 通過培養基的體積計算:

單位定義: 一個酶活性的單位定義為酶消耗的量 1 每分鐘反應系統中NADH的NMOL, 每個ML液體.

GAPDH活動 (單位/毫升) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷vs÷t = 1072×ΔA

 

e: 納德的摩爾滅絕係數: 6.22×103公升/摩爾/厘米; d: 淺色小路, 1 公分;

繩子: 總反應體積, 0.001 L;

VS: 反應系統中的樣本體積, 0.03 毫升; 變速: 添加了提取解決方案的數量, 1 毫升; 心肺復甦: 樣品蛋白濃度, 毫克/毫升;

瓦, 樣品質量, G;

時間: 反應時間, 5 分分鐘;

109: 轉換因子, 1 mol = 109 納摩爾;

500: 細胞數量, 5 百萬.

筆記:

1. 當A1小於 0.8 或ΔA大於 0.7, 建議測定前先稀釋樣品.
2. 空白管是用於測試每種試劑質量的試管. 在正常條件下, 更改不超過01.

實驗範例:

1. 服用0.1克兔腎臟, 添加 1 萃取液毫升數, 在冰浴中勻漿, 然後在8000克離心, 4℃為 20 分分鐘, 拿上清液並將其放在冰上, 然後根據確定步驟使用微石英比色杯, 測算: ΔAT= A1T-A2T = 0.815-0.158 = 0.657, ΔAB= A1b – A2B = 0.865-0.864 = 0.001, ΔA=ΔAT – ΔAB= 656.

GAPDH活動 (U/克質量) = 1072×ΔA÷w = 7032.32 U/克質量.

2. 服用0.1克三葉草, 添加 1 萃取液毫升數, 在冰浴中勻漿, 然後以8000克離心，4℃ 20 分分鐘, 拿上清液並將其放在冰上, 然後根據確定步驟進行操作, 用微石英比色杯測量和計算, ΔAT= A1T – A2T = 1.026-1.017 = 0.009, ΔAB= A1b – A2B = 0.865-0.864 = 0.001, ΔA=ΔAT – ΔAB= 008.

GAPDH活動 (U/克質量) = 1072 ×ΔA÷w = 85.76 u/g質量.

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