ไรโบนิวคลีเอส เอช, หรือเรียกสั้น ๆ ว่า RNase H, เป็นเอนไซม์เอนโดริโบนิวคลีเอสที่มีความสามารถในการไฮโดรไลซ์พันธะฟอสโฟไดเอสเตอร์ของสายอาร์เอ็นเอที่ผสมเข้ากับดีเอ็นเอโดยเฉพาะ. แม้ว่ากิจกรรมจะดูขัดแย้งกันก็ตาม, RNase H มีบทบาทสำคัญในกระบวนการเซลล์ขั้นพื้นฐานโดยเลือกกำหนดเป้าหมายส่วน RNA ในลูกผสม RNA-DNA. ลักษณะการระเบิดของความสามารถในการแตกแยกเฉพาะไซต์ทำให้เป็นเครื่องมืออเนกประสงค์ในเทคนิคอณูชีววิทยา.
เราจะสำรวจเชิงลึกว่า RNase H ทำอะไรได้บ้าง, มันทำงานอย่างไร, คุณสมบัติหลักและการใช้งานของผลิตภัณฑ์ RNase H ชนิดรีคอมบิแนนท์จาก NEB, และช่วยให้นักวิจัยเลือกเอนไซม์ RNase H ที่เหมาะสมกับความต้องการของพวกเขา.
ฟังก์ชั่นของ RNase H?
หน้าที่หลักของ RNase H คือการแยกสาย RNA ของ RNA-DNA duplexes, ปล่อยให้สาย DNA สมบูรณ์. การย่อย RNA แบบกำหนดเป้าหมายนี้ช่วยแก้ไขจุดตัดแบบไฮบริด RNA-DNA ที่สามารถเกิดขึ้นได้ในระหว่างการทำธุรกรรม DNA และ RNA ภายในเซลล์. กิจกรรมของ RNase H มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อกระบวนการเผาผลาญ DNA และ RNA ต่างๆ เช่น การจำลองดีเอ็นเอ, การถอดความ, และการสุกของชิ้นส่วนโอคาซากิ.
ช่วยป้องกันไม่ให้ไพรเมอร์ RNA ยังคงอยู่ใน DNA และลบการถอดเสียง RNA ที่ผสมเข้ากับเทมเพลต DNA เสริม. กระบวนการกำหนดเป้าหมายและทำลายส่วน RNA โดยเฉพาะในขณะที่ปกป้องส่วน DNA นี้เป็นศูนย์กลางของบทบาทของ RNase H ในการอำนวยความสะดวกในการทำธุรกรรมกรดนิวคลีอิกในร่างกาย.
RNase H ทำงานอย่างไรและมีฤทธิ์ของเอนไซม์อย่างไร?
RNase H ทำงานโดยระบุตำแหน่งบริเวณลูกผสม RNA-DNA แล้วแยกพันธะฟอสโฟไดสเตอร์ระหว่าง 3 โมเลกุลออกอย่างแม่นยำ′-กลุ่มไฮดรอกซิลของอาร์เอ็นเอไรโบสและกลุ่มฟอสเฟตของอาร์เอ็นเอไรโบสถัดไปในสายโซ่. มันกระตุ้นปฏิกิริยาไฮโดรไลซิสของกรด-เบส โดยไม่รบกวนความสมบูรณ์ของสาย DNA.
ในระดับโมเลกุล, RNase H จดจำจุดเชื่อมต่อ RNA-DNA และผูกเข้ากับโครงสร้างดูเพล็กซ์อย่างแน่นหนา. จากนั้นบริเวณที่ทำงานของมันจะตัดพันธะฟอสโฟไดสเตอร์ของสาย RNA ทีละตัวในขั้นตอนที่ 3′ ถึง 5′ ทิศทาง. กระบวนการนี้จะดำเนินต่อไปจนกว่าส่วน RNA ทั้งหมดจะลดลงโดยไม่ส่งผลกระทบต่อคู่ DNA. กิจกรรมของเอนไซม์เป้าหมายนี้เรียกว่ากิจกรรม RNase H และวัดปริมาณเป็นปริมาณของ RNase H ที่จำเป็นในการแยก RNA ในปริมาณเฉพาะในลูกผสม RNA-DNA ภายในระยะเวลาที่กำหนดภายใต้เงื่อนไขที่กำหนด.
คุณสมบัติหลักและการใช้งานของผลิตภัณฑ์ RNase H ของ NEB คืออะไร?
New England Biolabs หรือ NEB คือผู้ให้บริการชั้นนำด้านเอนไซม์คุณภาพสูงสำหรับการใช้งานด้านอณูชีววิทยา. RNase H ชนิดรีคอมบิแนนท์ของพวกมันเป็นเอนไซม์ที่ผ่านการขัดเกลาและมีคุณสมบัติที่เป็นประโยชน์หลายประการ. มาพร้อมกับบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาที่ได้รับการปรับปรุงเพื่อรองรับการทำงานของมันในช่วง pH และอุณหภูมิที่กว้าง. เป็นผลิตภัณฑ์รีคอมบิแนนท์, มันมีความสม่ำเสมอระหว่างแบทช์โดยไม่มีการปนเปื้อน.
RNase H ของ NEB แสดงฟังก์ชัน RNase H และความจำเพาะสูง, การย่อยสาย RNA ด้วย neb RNase H ของลูกผสม RNA-DNA แบบคัดเลือกโดยไม่รบกวน DNA. มีการประยุกต์ใช้เทคนิคต่างๆ เช่น การถอดรหัสแบบย้อนกลับ พีซีอาร์ (RT-PCR) ซึ่งจะช่วยแก้ไขลูกผสม RNA-cDNA ที่เกิดขึ้นระหว่างการสังเคราะห์สายแรกโดยกิจกรรม RNase H. RNase H ที่ทนความร้อนได้ของ NEB ยังมีให้สำหรับการใช้งานกรดนิวคลีอิกที่มีอุณหภูมิสูงอีกด้วย.
เงื่อนไขและบัฟเฟอร์ใดที่จำเป็นสำหรับกิจกรรม RNase H ที่เหมาะสมที่สุด?
เพื่อกิจกรรม RNase H ที่เหมาะสมที่สุด, RNase H ชนิดลูกผสมของ NEB ต้องการสภาวะปฏิกิริยาเฉพาะและส่วนประกอบบัฟเฟอร์. บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 10X RNase H ที่ให้มาประกอบด้วย ทริส-HCl, เคซีแอล, MgCl2, และ DTT เพื่อรักษาความแรงของไอออนิกและ pH ที่ถูกต้องสำหรับการทำงานของเอนไซม์สูงสุด. RNase H ทำงานได้ดีที่สุดที่ pH 8.3 และ 37°C. การรวมไอออน Mg2+ ไว้ในบัฟเฟอร์มีความสำคัญเนื่องจากฟังก์ชัน RNase H ขึ้นอยู่กับ Mg2+ สำหรับกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยา.
DTT ทำหน้าที่เป็นตัวรีดิวซ์เพื่อปกป้องเอนไซม์จากการเกิดออกซิเดชัน. ปฏิกิริยาจะเกิดขึ้นโดยการรวมเอนไซม์ RNase H, สารตั้งต้น RNA-DNA ไฮบริดและบัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 1X. การบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมเพิ่มความเสถียรของ RNase H และการแยกส่วน RNA มอยอิตีจากลูกผสมที่สม่ำเสมอ.
กรดนิวคลีอิกประเภทใดที่ RNase H Act-On และไม่ Act-On?
แม้ว่า RNase H จะเลือกกำหนดเป้าหมาย RNA ในดูเพล็กซ์ RNA-DNA, มันไม่ย่อย RNA หรือ DNA สายเดี่ยว. มันไม่แยก DNA ที่มีเกลียวคู่ออกด้วย. กิจกรรมของเอนไซม์ RNase H ที่แม่นยำนั้นมีไว้สำหรับ RNA ที่ผสมเข้ากับสาย DNA โดยเฉพาะ. เอนไซม์ระบุและลดระดับส่วน RNA ของเฮเทอโรดูเพล็กซ์ RNA-DNA ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยไม่รบกวนความสมบูรณ์และความต่อเนื่องของคู่ DNA.
RNase H แสดงฤทธิ์เพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลยบนสายกรดนิวคลีอิกเอกพจน์หรือบนโมเลกุล DNA ที่มีเกลียวคู่ซึ่งขาดจุดเชื่อมต่อ RNA-DNA. ความจำเพาะของสารตั้งต้นที่เข้มงวดนี้ช่วยให้สามารถกำจัด RNA ที่ควบคุมและกำหนดเป้าหมายได้จากคอมเพล็กซ์ไฮบริดที่จำเป็นสำหรับการทำธุรกรรมกรดนิวคลีอิกต่างๆ.
แหล่งที่มาและวิธีการผลิตสำหรับ Recombinant RNase H?
RNase H ของ NEB ผลิตขึ้นแบบรีคอมบิแนนท์ใน E.coli เพื่อความบริสุทธิ์และความสม่ำเสมอสูงระหว่างแบทช์. แหล่งที่มาของการโคลนคือยีน RNase H ดั้งเดิมที่แยกได้จาก Escherichia coli ซึ่งมีรหัสสำหรับ RNase H ภายนอกที่มีอยู่ในเซลล์ E.coli. ยีนนี้ถูกแทรกเข้าไปในเวกเตอร์การแสดงออกและขยายในสายพันธุ์ E.coli ที่ไม่ทำให้เกิดโรค. การเหนี่ยวนำของเวกเตอร์นำไปสู่การแสดงออกของโปรตีน RNase H ชนิดรีคอมบิแนนท์ระดับสูง.
จากนั้น RNase H ที่แสดงออกมากเกินไปจะถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์โครมาโทกราฟีเพื่อให้ได้การเตรียมที่มีความบริสุทธิ์สูงโดยปราศจากนิวคลีเอสที่ปนเปื้อน. การตรวจสอบการควบคุมคุณภาพรับรองว่าเอนไซม์รีคอมบิแนนท์แสดงฤทธิ์และความจำเพาะของ RNase H ที่แท้จริง. ผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้ายจะมาพร้อมกับบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาที่ปรับให้เหมาะสมกับฟังก์ชันการทำงาน.
RNase H ของ NEB ใช้ในเทคนิคอณูชีววิทยาเช่น RT-PCR อย่างไร?
การใช้งานที่สำคัญอย่างหนึ่งของ RNase H คือการทำ Reverse Transcription PCR (RT-PCR) ซึ่งจะช่วยแก้ไขลูกผสม RNA-cDNA ที่เกิดขึ้นระหว่างสายแรก การสังเคราะห์ซีดีเอ็นเอ. ใน RT-PCR, เทมเพลต RNA จะถูกคัดลอกแบบย้อนกลับไปยัง DNA เสริมของมันเป็นครั้งแรก (ซีดีเอ็นเอ) โดยใช้ไพรเมอร์ DNA. กระบวนการนี้ส่งผลให้เกิดดูเพล็กซ์ไฮบริด RNA-cDNA. จากนั้น RNase H ชนิดรีคอมบิแนนต์ของ NEB จะถูกนำมาใช้เพื่อเลือกลดระดับสาย RNA ของลูกผสมเหล่านี้ เหลือเพียง cDNA สายเดี่ยวเท่านั้น.
การลดระดับเทมเพลต RNA ดั้งเดิมจะป้องกันไม่ให้รบกวนการขยาย PCR ในภายหลัง. โดยการแยก RNA อย่างมีประสิทธิภาพ, RNase H ช่วยให้สามารถขยายแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลเฉพาะ cDNA เพื่อตรวจจับและวิเคราะห์การถอดเสียง RNA ที่เฉพาะเจาะจง. ความแม่นยำและประสิทธิภาพในการย่อยสลาย RNA แบบไฮบริดภายใต้สภาวะที่เหมาะสมจะช่วยเพิ่มคุณภาพและความไวของการวิเคราะห์ RT-PCR.
ช่วงอุณหภูมิและจุดยับยั้งความร้อนสำหรับ RNase H?
RNase H ปกติจาก NEB ทำงานที่อุณหภูมิระหว่าง 25-42°C โดยมีกิจกรรมสูงสุดประมาณ 37°C. มันจะปิดการใช้งานอย่างถาวรเมื่อได้รับความร้อนถึง 65°C เป็นเวลา 20 นาที. สำหรับการใช้งานที่ต้องการอุณหภูมิที่สูงขึ้น, NEB ยังมี RNase H ในรูปแบบที่ทนความร้อนได้. RNase H ทนความร้อนนี้ทำงานได้อย่างสมบูรณ์ระหว่าง 25-80°C พร้อมเพิ่มกิจกรรมที่อุณหภูมิสูงขึ้นถึง 50-60°C.
มันยังคงความเสถียรแม้หลังจากให้ความร้อนถึง 80°C, ทำให้เหมาะสำหรับความต้องการเทคนิคกรดนิวคลีอิกที่ทำงานในสภาวะการหมุนเวียนความร้อนที่สูงขึ้น. RNase H ที่ทนความร้อนได้สามารถทนต่อขั้นตอนการยับยั้งความร้อนและการรักษาด้วยโปรตีเอส K, ให้ความยืดหยุ่นมากขึ้น. RNase H ทั้งสองเวอร์ชันมาพร้อมกับเอกสารประกอบผลิตภัณฑ์ที่ครอบคลุมเพื่อการใช้งานอย่างมีประสิทธิภาพ.
วิธีเลือกระหว่าง RNase H แบบปกติและแบบทนความร้อนจาก NEB?
ตัวเลือกระหว่าง RNase H แบบปกติและแบบทนความร้อนได้ขึ้นอยู่กับข้อกำหนดด้านอุณหภูมิและขั้นตอนการทำงาน. RNase H แบบปกติเป็นตัวเลือกที่คุ้มค่าหากสามารถทำปฏิกิริยาได้ที่อุณหภูมิต่ำกว่า 42°C, เช่นเดียวกับใน RT-PCR มาตรฐาน. RNase H ที่ทนความร้อนได้มีข้อดีสำหรับเทคนิคที่เกี่ยวข้องกับวงจรความร้อนที่เพิ่มขึ้นตั้งแต่ 50-80°C เช่น PCR แบบซ้อน, การขยายแบบไอโซเทอร์มอลแบบอาศัยการถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT-LAMP), และการใช้งานโปรไฟล์ความร้อนอื่นๆ. คุณสมบัติทนความร้อนป้องกันการสูญเสียกิจกรรมระหว่างขั้นตอนการทำความร้อนหลายขั้นตอน.
นักวิจัยที่ทำการวิเคราะห์กรดนิวคลีอิกที่อุณหภูมิสูงได้ประโยชน์จาก RNase H ที่ทนความร้อนได้ซึ่งมีช่วงการทำงานและความทนทานที่ขยายออกไป. โดยรวม, เอนไซม์ RNase H ชนิดรีคอมบิแนนท์ของ NEB มอบเครื่องมือที่เชื่อถือได้สำหรับการควบคุมการย่อย RNA ในคอมเพล็กซ์ RNA-DNA ในการใช้งานที่หลากหลาย.
สรุป
สรุปแล้ว, โพสต์ในบล็อกนี้มีวัตถุประสงค์เพื่ออธิบายอย่างครอบคลุมว่า RNase H คืออะไร, มันทำงานอย่างไรโดยเฉพาะ, คุณลักษณะสำคัญของผลิตภัณฑ์ RNase H ชนิดรีคอมบิแนนท์ของ NEB, สภาวะปฏิกิริยาที่เหมาะสมที่สุด, การประยุกต์ใช้เทคนิคเช่น RT-PCR, และข้อควรพิจารณาในการเลือกเอนไซม์ RNase H ที่เหมาะสม.
โดยเจาะลึกกิจกรรมของเอนไซม์ที่น่าสนใจและความสามารถในการแตกแยกของ RNA เป้าหมายในลักษณะที่เรียบง่ายแต่มีรายละเอียด, ฉันหวังว่าสิ่งนี้จะช่วยให้ความกระจ่างมากขึ้นเกี่ยวกับ RNase H ที่หลากหลายและบทบาทสำคัญของมันในการทำธุรกรรมของกรดนิวคลีอิก. โปรดแจ้งให้เราทราบหากต้องการคำชี้แจงเพิ่มเติมในด้านอื่นๆ.
