PCR-SSCP คืออะไร? แอปพลิเคชันและคู่มือฉบับสมบูรณ์

ด้วยการพัฒนาเทคนิคทางอณูชีววิทยา, วิธีการต่างๆ ในการตรวจจับโครงสร้างยีนและการกลายพันธุ์เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่อง. โดยเฉพาะภายหลังการถือกำเนิดของ พีซีอาร์ เทคโนโลยี, เทคนิคการตรวจจับยีนต่างๆ ร่วมกับ PCR ได้ช่วยขับเคลื่อนความก้าวหน้าของการวิจัยยีนต่อไป. เทคนิคต่างๆ เช่น การจัดลำดับโดยตรงของผลิตภัณฑ์ PCR แบบอสมมาตร, ความแตกแยกของไรโบนิวคลีเอส (อาร์เอ็นเอ), และการวิเคราะห์พหุสัณฐานความยาวแฟรกเมนต์จำกัด (รฟล) ได้กลายเป็นเครื่องมืออันทรงพลังสำหรับการวิเคราะห์ยีน. อย่างไรก็ตาม, วิธีการเหล่านี้ค่อนข้างยุ่งยากในการใช้งาน, มีข้อจำกัดที่สำคัญ, หรือต้องมีเงื่อนไขการทดลองสูง, ทำให้ไม่เหมาะกับห้องปฏิบัติการทางคลินิกทั่วไป.

เปิดตัวใน 1989, PCR-SSCP (ความหลากหลายทางโครงสร้างแบบเส้นเดียว) ได้รับการปรับปรุงและปรับแต่งอย่างต่อเนื่อง, ทำให้มันง่ายขึ้น, เร็วขึ้น, และวิธีการที่ละเอียดอ่อนมากขึ้นในการตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน. ไม่เพียงแต่ใช้สำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์ของจุดและการลบและการแทรกลำดับสั้นๆ เท่านั้น แต่ยังนำไปใช้ในการวัดปริมาณ DNA ด้วย, ติดตามการปนเปื้อนข้ามในการทดลองวินิจฉัย PCR, และตรวจสอบแหล่งที่มาของการติดเชื้อ. เนื่องจากข้อได้เปรียบที่โดดเด่นของ SSCP, มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา.

หลักการและลักษณะของ SSCP

• การค้นพบและแนวคิดพื้นฐาน:
  • DNA สายเดี่ยว (ssDNA) แฟรกเมนต์แสดงโครงสร้างการพับเชิงพื้นที่ที่ซับซ้อนซึ่งดูแลโดยปฏิกิริยาภายในโมเลกุล, การจับคู่ฐานเป็นหลัก.
  • การเปลี่ยนแปลงฐานเดียวสามารถเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเชิงพื้นที่ได้อย่างมีนัยสำคัญหรือเล็กน้อย, ส่งผลให้เกิดรูปแบบการอพยพที่แตกต่างกันในเจลโพลีอะคริลาไมด์.
• กลไกการแยก:
  • อิเล็กโตรโฟรีซิสเจลโพลีอะคริลาไมด์ที่ไม่ทำให้เสียสภาพ (หน้าหนังสือ) สามารถแยกโมเลกุล ssDNA ได้อย่างรวดเร็วโดยมีรูปร่างที่แตกต่างกันเนื่องจากการอุดตันในเจลในระดับที่แตกต่างกัน.
• การวิเคราะห์ SSCP:
  • ชื่อ Polymorphism โครงสร้างเส้นเดียว (สสส) โดยนักวิจัยชาวญี่ปุ่น Orita และเพื่อนร่วมงาน.
  • นำไปใช้เพื่อตรวจจับการกลายพันธุ์ของยีนในผลิตภัณฑ์ที่ขยายด้วย PCR, เพิ่มความเรียบง่ายและละเอียดอ่อน.
• กระบวนการพื้นฐาน:
  1. การขยาย PCR: ขยาย DNA เป้าหมาย.
  2. การเสียสภาพและการคืนสภาพ: ทำลายธรรมชาติของผลิตภัณฑ์ PCR ที่เฉพาะเจาะจงและเปลี่ยนธรรมชาติอย่างรวดเร็วเพื่อสร้างโมเลกุล DNA สายเดี่ยวที่มีโครงสร้างเชิงพื้นที่เฉพาะ.
  3. หน้าที่ไม่ทำให้เสื่อมเสีย: ดำเนินการอิเล็กโตรโฟรีซิสเจลโพลีอะคริลาไมด์ที่ไม่ทำให้เสียสภาพกับ DNA สายเดี่ยวในปริมาณที่เหมาะสม.
  4. การตรวจจับ: วิเคราะห์ผลลัพธ์โดยใช้การถ่ายภาพรังสีอัตโนมัติ, การย้อมสีเงิน, หรือการย้อมสีเอทิเดียมโบรไมด์.
• การตีความ:
  • การเปลี่ยนแปลงอัตราการย้ายของ ssDNA เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมปกติบ่งชี้ถึงการเปลี่ยนแปลงในโครงสร้าง, บ่งบอกถึงการกลายพันธุ์พื้นฐานในส่วน DNA นั้น.
• ข้อดี:
  • เรียบง่าย, เร็ว, และวิธีการละเอียดอ่อน.
  • ไม่ต้องใช้อุปกรณ์พิเศษ.
  • เหมาะสำหรับห้องปฏิบัติการทางคลินิก.
• ข้อจำกัด:
  • ตรวจพบการกลายพันธุ์เท่านั้น; จำเป็นต้องมีการจัดลำดับเพิ่มเติมเพื่อระบุตำแหน่งและประเภทของการกลายพันธุ์ที่แน่นอน.
  • จำเป็นต้องมีเงื่อนไขอิเล็กโตรโฟรีซิสที่เข้มงวด.
  • ผลลบลวงที่เป็นไปได้หากการกลายพันธุ์ของจุดไม่เปลี่ยนแปลงโครงสร้าง ssDNA อย่างมีนัยสำคัญ หรือหากเงื่อนไขอื่น ๆ แทรกแซง.
• ประสิทธิภาพการตรวจจับ:
  • แม้จะมีข้อจำกัดก็ตาม, SSCP มีอัตราการตรวจจับสูงเมื่อเทียบกับวิธีการอื่นๆ.
  • สามารถระบุการกลายพันธุ์ที่ไม่ทราบสาเหตุภายในชิ้นส่วน DNA เป้าหมาย.
  • ทาคาโอะแสดงให้เห็นว่า SSCP สามารถตรวจจับได้ 90% ของการกลายพันธุ์แบบเบสเดี่ยวในชิ้นส่วน DNA ที่สั้นกว่า 300 บีพี.
• การใช้งานเพิ่มเติม:
  • SSCP สามารถแยก ssDNA กลายพันธุ์ด้วยอัตราการย้ายที่แตกต่างกันผ่านโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส.
  • ช่วยให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมและระบุชิ้นส่วน DNA กลายพันธุ์ในระดับลำดับ.

การพัฒนาและปรับปรุง SSCP

• การพัฒนาเบื้องต้น:
  • เริ่มแรก, SSCP เกี่ยวข้องกับการรวมไอโซโทปไว้ในผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณ PCR, และผลลัพธ์ถูกแสดงผ่านระบบบันทึกภาพอัตโนมัติ. สิ่งนี้ทำให้เกิดความท้าทายในการนำไปใช้อย่างแพร่หลาย.
• ลดความซับซ้อน:
  • การผสมผสานระหว่างการย้อมสี DNA ซิลเวอร์ด้วย PCR-SSCP, โดยเฉพาะอย่างยิ่งการใช้การย้อมสีเอทิเดียมโบรไมด์โดยตรง, ทำให้วิธีการง่ายขึ้นมาก.
• การปรับปรุงที่น่าสังเกตล่าสุด:
  • การวิเคราะห์อาร์เอ็นเอ-SSCP:
    • หลักการพื้นฐาน: RNA มีโครงสร้างระดับทุติยภูมิและตติยภูมิที่ซับซ้อนมากขึ้น, ทำให้มีความไวสูงต่อการกลายพันธุ์แบบเบสเดียว, จึงเพิ่มอัตราการตรวจจับ.
    • อัตราการตรวจจับการกลายพันธุ์สามารถเกินได้ 90%.
    • RNA มีแนวโน้มที่จะสร้างเส้นคู่น้อยกว่า, ทำให้สามารถใช้อิเล็กโทรโฟรีซิสในปริมาณที่มากขึ้น, ซึ่งเป็นประโยชน์ต่อการย้อมสีเอทิเดียมโบรไมด์.
    • อย่างไรก็ตาม, วิธีนี้จะเพิ่มขั้นตอนการถอดรหัสแบบย้อนกลับและต้องใช้ไพรเมอร์ที่ยาวขึ้นซึ่งมีลำดับโปรโมเตอร์ RNA polymerase, เพิ่มความซับซ้อน.
• การรวม SSCP เข้ากับวิธีการตรวจจับการกลายพันธุ์อื่นๆ:
  • การวิเคราะห์เฮเทอโรดูเพล็กซ์ (มัน):
    • ปรับปรุงอัตราการตรวจจับอย่างมีนัยสำคัญเมื่อรวมกับ SSCP.
    • เกี่ยวข้องกับการไฮบริดไลซ์โพรบกับ ssDNA หรือ RNA เป้าหมาย. สายลูกผสมที่มีคู่เบสที่ไม่ตรงกันสามารถแยกออกจากสายลูกผสมเสริมโดยสมบูรณ์ผ่านอิเล็กโตรโฟรีซิสในเจล PAG ที่ไม่ทำให้เสียสภาพ.
    • การทำการวิเคราะห์ SSCP และ Het ในลำดับเป้าหมายเดียวกันสามารถบรรลุผลได้ใกล้เคียงกัน 100% อัตราการตรวจจับการกลายพันธุ์ของจุด, ในขณะที่ยังคงความเรียบง่ายในการทดลองไว้.

ขั้นตอนการทำ PCR-SSCP

การเตรียมเจลตามความยาวของแฟรกเมนต์ DNA

สำหรับชิ้นส่วน DNA ที่สั้นกว่า 1Kb, เลือกความเข้มข้นของเจลโพลีอะคริลาไมด์ได้ดังนี้:

• ความยาวชิ้นส่วน DNA (บีพี): % ความเข้มข้นของอะคริลาไมด์
  • 1KB–700b: 3.5%
  • 700ข–500b: 5%
  • 500ข–200b: 8%
  • 200ข: 12%

การเตรียมการก่อน SSCP

• การขยาย PCR: ขยายผลิตภัณฑ์เฉพาะโดยให้มีรอยเปื้อนน้อยที่สุด (ยืนยันโดย agarose gel electrophoresis).

1. การเตรียมเจลโพลีอะคริลาไมด์ (พีเอจี)

• เตรียมสารละลายเจลตามความเข้มข้นที่ต้องการจากตารางด้านบน.
• ใส่หวีลงในแม่พิมพ์เจล.
• เทสารละลายเจลจากปลายด้านหนึ่งของหวี, เอียงแม่พิมพ์ไปทางปลายเทขณะที่เจลไปถึงซี่ฟันเพื่อป้องกันการเกิดฟอง.
• ปล่อยให้เจลแข็งตัวที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาหนึ่ง 1 ชั่วโมง.
• ถอดหวีออกแล้วเติมบัฟเฟอร์ 1×TBE ที่ด้านบนของเจลเพื่อปกปิด.

2. อิเล็กโทรโฟเรซิส

1. เอา 10 μlของผลิตภัณฑ์ PCR.
2. เพิ่ม 10 μl ของสารเปลี่ยนสภาพ (95% ฟอร์มาไมด์, 10 มิลลิโมล/ลิตร EDTA, 0.02% โบรโมฟีนอลสีน้ำเงิน).
3. เพิ่ม 30 ไมโครลิตรของน้ำมันแร่.
4. ต้มเพื่อ 5 นาที, แล้วนำไปแช่ในอ่างน้ำแข็งทันทีเป็นอย่างน้อย 2 นาที.
5. ใส่เฟสที่เป็นน้ำทั้งหมดลงบนเจล.
6. ดำเนินการอิเล็กโทรโฟเรซิสที่อุณหภูมิ 10-15°C:
   • เริ่มต้นด้วย 300V สำหรับ 5 นาที.
   • ต่อด้วยไฟ 120V สำหรับ 8 ชั่วโมง.
7. หลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิส, ย้อมเจลในบัฟเฟอร์ 1×TBE ที่ประกอบด้วย 0.5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เอทิเดียม โบรไมด์ สำหรับ 30-45 นาที.
8. สังเกตภายใต้แสง UV หรือดำเนินการย้อมสีเงิน.

3. การย้อมสีเงิน

1. ล้าง PAG สองครั้งด้วยน้ำปราศจากไอออน.
2. แก้ไขเจลในสารละลายของ 10% เอทานอลและ 0.5% กรดอะซิติกสำหรับ 6 นาที.
3. ล้างสองครั้งด้วยน้ำปราศจากไอออน.
4. ดื่มด่ำไปกับ 0.2% ซิลเวอร์ไนเตรต (AgNO3) โซลูชั่นสำหรับ 10 นาที.
5. ล้าง 3-5 ครั้งด้วยน้ำปราศจากไอออน.
6. พัฒนาในการแก้ปัญหาของ 1.5% โซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH) และ 0.4% ฟอร์มาลดีไฮด์สำหรับ 7 นาที.
7. หยุดการพัฒนาด้วย 0.75% โซเดียมคาร์บอเนต (นาCO3).

การประยุกต์ใช้ SSCP

เนื่องจาก Orita และเพื่อนร่วมงานใช้ SSCP ในการวิเคราะห์ความหลากหลายทางดีเอ็นเอของมนุษย์, วิธีนี้ได้ถูกนำไปใช้อย่างกว้างขวางในด้านต่างๆ, รวมถึงการตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีนที่เกี่ยวข้องกับโรคมะเร็งและโรคทางพันธุกรรม, ตลอดจนการติดตามการพิมพ์ไวรัสและการปนเปื้อน.

การตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีนมะเร็ง

• การกลายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก:
  • SSCP ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีนที่เกี่ยวข้องกับมะเร็งชนิดต่างๆ เช่น แอสโตรไซโตมา, เนื้องอกในสมอง, มะเร็งปอดชนิดเซลล์ขนาดเล็ก, มะเร็งกระเพาะอาหาร, และมะเร็งลำไส้ใหญ่.
  • ได้ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน P53 ในเนื้องอกเหล่านี้ และการกลายพันธุ์ของยีน ras ในมะเร็งปอด.
• การสมัครที่ประสบความสำเร็จ:
  • ล่าสุด, ซูกาโนะ และคณะ. ใช้ SSCP เปื้อนเงินเพื่อตรวจจับการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่งได้สำเร็จ 12 ของยีน c-Ki-ras2, เสร็จสิ้นกระบวนการอิเล็กโตรโฟรีซิสและการย้อมสีภายใน 2.5 ชั่วโมง.

การวิจัยโรคทางพันธุกรรม

• SSCP ใช้ในการศึกษายีนที่เกี่ยวข้องกับโรคทางพันธุกรรมเช่น:
  • โรคซิสติกไฟโบรซิส: การตรวจหาการกลายพันธุ์ในยีน CFTR.
  • ประเภทนิวโรไฟโบรมาโทซิส 1: การวิเคราะห์การกลายพันธุ์ของยีน.
  • Polyposis Adenomatous ครอบครัว: การวิจัยยีนที่เกี่ยวข้องกับภาวะนี้.
• RNA-SSCP เทียบกับ. DNA-SSCP:
  • ชาร์การ์ และคณะ. ใช้ RNA-SSCP เพื่อตรวจจับลำดับยีนใน 28 ผู้ป่วยโรคฮีโมฟีเลียบี.
  • เปิดเผยการเปรียบเทียบกับ DNA-SSCP และการจัดลำดับยีนโดยตรง 20 การกลายพันธุ์พื้นฐานในยีน Factor IX ขนาด 2.6kb, ด้วยการตรวจจับ RNA-SSCP 70% ของการกลายพันธุ์เหล่านี้เมื่อเปรียบเทียบกับ 35% ตรวจพบโดย DNA-SSCP, แสดงให้เห็นถึงความไวที่สูงขึ้นของ RNA-SSCP.

การพิมพ์ไวรัสและการตรวจสอบการปนเปื้อน

• การพิมพ์ไวรัส:
  • SSCP ใช้สำหรับการพิมพ์ไวรัสและติดตามการปนเปื้อนในการทดลอง PCR.
  • YaP ใช้ PCR แบบซ้อนเพื่อตรวจหาตัวอย่าง HBV จากภูมิภาคต่างๆ, ตามด้วยการวิเคราะห์ SSCP, ซึ่งเปิดเผยรูปแบบ SSCP ที่แตกต่างกันสำหรับแต่ละตัวอย่าง, บ่งชี้ความแปรปรวนในระดับภูมิภาคใน DNA HBV และขจัดความเป็นไปได้ของการปนเปื้อนข้าม.
• การตรวจสอบการปนเปื้อน:
  • SSCP ทำหน้าที่เป็นวิธีการที่เชื่อถือได้เพื่อให้มั่นใจถึงความถูกต้องแม่นยำของผลการวินิจฉัย PCR.

การศึกษาการส่งผ่านเชื้อโรค

• SSCP ใช้เพื่อศึกษาเส้นทางการแพร่กระจายของเชื้อโรค.

การวิเคราะห์ดีเอ็นเอเชิงปริมาณ

• การวิเคราะห์เซลล์มะเร็งเต้านม:
  • สสส, รวมกับ PCR ที่แข่งขันได้, ใช้สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของยีน P53 กลายพันธุ์ในเซลล์มะเร็งเต้านม.
  • ข้อดีของวิธีนี้อยู่ที่การใช้มาตรฐานภายในที่แตกต่างจาก DNA เป้าหมายเพียงฐานเดียว, รับประกันเงื่อนไขการขยายที่เหมือนกันและทำให้ปริมาณ DNA แม่นยำยิ่งขึ้น.

ข้อควรระวังสำหรับ SSCP

SSCP เป็นไปอย่างรวดเร็ว, เรียบง่าย, และวิธีการที่ละเอียดอ่อนในการตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน. เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด, ควรปฏิบัติตามข้อควรระวังต่อไปนี้:

การทำซ้ำ:

• ปัจจัยหลักที่ส่งผลต่อความสามารถในการทำซ้ำของ SSCP คือแรงดันและอุณหภูมิอิเล็กโตรโฟรีซิส. การรักษาเงื่อนไขเหล่านี้ให้คงที่ช่วยให้มั่นใจได้ว่ารูปแบบ SSCP สามารถทำซ้ำได้ดี.
• โดยทั่วไป, รูปแบบ SSCP แสดงแถบ DNA เส้นเดี่ยวสองแถบ, แต่บางครั้งอาจมีเพียงหนึ่งหรือมากกว่าสามแถบเท่านั้นที่อาจปรากฏขึ้นเนื่องจากโครงสร้างเชิงพื้นที่ที่คล้ายกันระหว่างโมเลกุล DNA สายเดี่ยวสองโมเลกุล. การมีอยู่ของแถบมากกว่าสามแถบสามารถบ่งบอกถึงส่วนผสมของชิ้นส่วน DNA แบบไวด์และกลายพันธุ์.

ผลกระทบของความยาวลำดับดีเอ็นเอเป้าหมาย:

• SSCP มีประสิทธิภาพในการตรวจจับการกลายพันธุ์ของจุดในลำดับ DNA หรือ RNA ที่สั้นกว่าในลำดับที่ยาวกว่า. อาจเป็นเพราะการเปลี่ยนแปลงฐานเดียวในโมเลกุลที่ยาวขึ้นมีผลกระทบน้อยกว่าในการรักษาโครงสร้างเชิงพื้นที่.
• นักวิจัยบางคนเชื่อว่าสำหรับสาย DNA ที่สั้นกว่า 400 บีพี, ความยาวไม่ส่งผลต่อประสิทธิภาพของ SSCP. การเลือกเงื่อนไขการทดลองอย่างระมัดระวังสามารถบรรลุอัตราการตรวจจับที่มากกว่า 90% สำหรับจุดกลายพันธุ์ใน 354 ชิ้นส่วนดีเอ็นเอ bp.

แรงดันและอุณหภูมิอิเล็กโตรโฟเรซิส:

• เพื่อรักษาโครงสร้างเชิงพื้นที่ที่มั่นคงของ DNA สายเดี่ยว, SSCP ควรดำเนินการที่อุณหภูมิต่ำกว่า (โดยทั่วไปจะอยู่ระหว่าง 4°C ถึง 15°C). ไฟฟ้าแรงสูงที่จุดเริ่มต้น (250วี) สำหรับ 5 นาทีช่วยในการแยก DNA สายเดี่ยวที่มีโครงสร้างต่างกันในตอนแรกโดยไม่เพิ่มอุณหภูมิเจลอย่างมีนัยสำคัญ. ตามด้วยแรงดันไฟฟ้าที่ต่ำกว่า (ประมาณ 100V) เพื่อแยกเส้นสายออกไปอีก.
• ควรกำหนดแรงดันไฟฟ้าที่แน่นอนสำหรับอิเล็กโทรโฟรีซิสตามเงื่อนไขการทดลองเฉพาะ.

ผลกระทบของตำแหน่งการกลายพันธุ์ของจุด:

• ตำแหน่งของการกลายพันธุ์ของจุดใน DNA หรือ RNA ส่งผลต่ออัตราการตรวจจับ SSCP ขึ้นอยู่กับบทบาทในการรักษาโครงสร้างเชิงพื้นที่, แทนที่จะเป็นตำแหน่งเชิงเส้นบนโซ่.
• การกลายพันธุ์ในบริเวณใจกลางของ DNA โดยทั่วไปจะตรวจพบได้ง่ายกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการกลายพันธุ์บริเวณปลายสุด.
• อย่างไรก็ตาม, แม้แต่การกลายพันธุ์ในภาคกลางก็อาจตรวจไม่พบหากไม่ได้เปลี่ยนแปลงโครงสร้างเชิงพื้นที่อย่างมีนัยสำคัญ. เช่น, การศึกษาของไวท์พบว่ามีเพียงเท่านี้ 2 ออกจาก 9 ตรวจพบตัวอย่างที่มีการกลายพันธุ์แบบจุดที่วงของโครงสร้างกิ๊บ, บ่งบอกถึงอัตราการตรวจจับของ 22%.

การตีความผลลัพธ์ SSCP:

• SSCP แยก DNA สายเดี่ยวตามโครงสร้างเชิงพื้นที่มากกว่าน้ำหนักโมเลกุลหรือประจุ. บางครั้ง, อัตราการอพยพของลูกโซ่ปกติและลูกโซ่กลายพันธุ์นั้นใกล้เคียงกันมาก, ทำให้ยากต่อการแยกแยะระหว่างพวกเขา.
• โดยทั่วไป, ความยาวอิเล็กโทรโฟรีซิส 16-18 ต้องใช้ cm เพื่อกำหนดผลลัพธ์อย่างแม่นยำตามขีดจำกัดการตรวจจับ, ซึ่งเป็นระยะทางอิเล็กโตรโฟเรซิสที่เล็กที่สุดที่มองเห็นได้ระหว่างชิ้นส่วนดีเอ็นเอกลายพันธุ์และปกติ.
• หากระยะห่างเกินขีดจำกัดการตรวจจับ (เช่น., 3มม), มีการระบุการกลายพันธุ์. ระยะทางที่น้อยลงแสดงว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลง. การตั้งค่าขีดจำกัดการตรวจจับต่ำอาจทำให้เกิดผลบวกลวงได้.
• เงื่อนไขอื่นๆ, เช่นจำนวนสินค้า PCR ที่โหลด, ระดับของการเชื่อมขวาง PAG, และความเข้มข้นของเจล, ควรเลือกตามความต้องการในการทดลองเฉพาะ.

รายละเอียด PCR-SSCP ตามขั้นตอน

การจัดเตรียมตัวอย่าง

1. การขยายและการตรวจจับ PCR:
   • ดำเนินการขยาย PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่เหมาะสม และเลือกอุณหภูมิการอบอ่อนที่เหมาะสม.
   • ตรวจจับผลิตภัณฑ์เครื่องขยายสัญญาณโดยการรันบน 2-2.5% agarose gel ผ่านทางอิเล็กโตรโฟรีซิสแนวนอน. โหลด 3-5 µl ของผลิตภัณฑ์ PCR.
   • ความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของผลิตภัณฑ์ PCR ควรอยู่ที่ประมาณ 10 ng/ไมโครลิตร.
2. การผสมผลิตภัณฑ์ PCR กับบัฟเฟอร์การเสียสภาพ:
   • เพิ่ม 5 µl ของบัฟเฟอร์ตัวอย่าง SSCP (บัฟเฟอร์ที่ทำให้เสียสภาพ, เช่นเดียวกับบัฟเฟอร์ลำดับใน “การโคลนโมเลกุล”) ไปที่ด้านล่างของท่อ PCR ที่สะอาด.
   • เพิ่มผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณ PCR ไปที่กึ่งกลางของบัฟเฟอร์. ปรับปริมาณตามการมองเห็นของสายรัดบนเจลอะกาโรส:
     • หากวงดนตรีมีความสดใส, เพิ่ม 1 มล.
     • หากผลลัพธ์ออกมาดีเยี่ยม, เพิ่ม 0.5 มล.
     • หากวงดนตรีไม่ชัดเจนมาก, เพิ่ม 1.5, 2, หรือ 3 µl ตามลำดับ.
   • เพิ่มปริมาณบัฟเฟอร์ตัวอย่างตามสัดส่วน, เช่น., สำหรับ 3 µl ของผลิตภัณฑ์ PCR, เพิ่ม 8 µl ของบัฟเฟอร์เพื่อการเสียสภาพที่ดีขึ้น.
3. การเสียสภาพของผลิตภัณฑ์ PCR:
   • ปั่นแยกหลอดเพื่อให้ตัวอย่างเข้มข้นที่ด้านล่าง.
   • เปลี่ยนสภาพตัวอย่างที่อุณหภูมิ 95°C สำหรับ 10 นาทีโดยใช้ เครื่องพีซีอาร์, จากนั้นจึงวางผลิตภัณฑ์ PCR ลงบนน้ำแข็งทันที 5 นาทีเพื่อป้องกันการกลับคืนสภาพเดิม.

   บันทึก: ขั้นตอน 3 และ 4 สามารถทำได้หลังจากขั้นตอนที่ 4 ของการเตรียมเจลในขณะที่รอให้เจลแข็งตัว.

การเตรียมเจล

1. การเตรียมแผ่นกระจก:
   • ล้างแผ่นแก้วแต่ละคู่ด้วยน้ำประปา ตามด้วย ddH2O.
   • เช็ดแผ่นกระจกให้แห้งด้วยกระดาษดูดซับ จากนั้นเช็ดด้วยเอทานอลแบบแอนไฮดรัส.
   • ปล่อยให้เอทานอลระเหยออกไป 2-3 นาที.
   • ประกอบแผ่นกระจกแล้ววางลงในแท่นหล่อเจล, ทำให้มั่นใจได้ว่าทั้งสองด้านและด้านล่างจะปลอดภัย.
   • ขันสกรูประกอบให้แน่นเพื่อให้แผ่นได้ระดับ. (ตรวจสอบรอยรั่วโดยใช้เอทานอลแบบแอนไฮดรัส)

เจลขนาดใหญ่ (50% ความเข้มข้นของกลีเซอรอล)

เจลขนาดเล็ก (50% ความเข้มข้นของกลีเซอรอล)

การเทเจล

1. การผสมเจล: หลังจากเตรียมสารละลายเจลตามสูตรที่ให้ไว้แล้ว, ผสมให้ละเอียดเพื่อให้แน่ใจว่ามีความสม่ำเสมอ.
2. เทลงในแผ่นกระจก: ค่อยๆ เทสารละลายเจลที่เตรียมไว้ลงในแผ่นกระจกที่ประกอบไว้. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีฟองอากาศติดอยู่ในระหว่างกระบวนการเท. หากพบฟองอากาศใดๆ, ค่อยๆ เอียงแผ่นเพื่อให้ฟองลอยขึ้นสู่พื้นผิว. การแตะด้านข้างของเพลตเบาๆ สามารถช่วยปล่อยฟองอากาศที่ติดอยู่ได้.
3. การใส่หวี: เมื่อระดับสารละลายเจลเหลือต่ำกว่าขอบด้านบนของแผ่นกระจกประมาณ 0.5 ซม, ใส่หวีเข้าไปในเจล. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีฟองอากาศติดอยู่ระหว่างฟันหวีและพื้นผิวเจล. หากมีฟองอากาศเกิดขึ้น, ถอดหวีออก, ปล่อยฟองอากาศ, และสอดหวีกลับเข้าไปอย่างระมัดระวัง.
4. ช่วยให้เจลโพลีเมอไรเซชัน: หลังจากใส่หวีแล้ว, ปล่อยให้เจลเกิดปฏิกิริยาโพลีเมอร์โดยการวางแผ่นเรียบหรือเอียงเล็กน้อย (น้อยกว่า 10 องศา) บนพื้นราบได้ประมาณ 30 นาที. ในช่วงเวลานี้, เจลจะเกิดปฏิกิริยาโพลีเมอร์และแข็งตัว.

บันทึก: นี่เป็นเวลาที่เหมาะสมในการดำเนินการสูญเสียสภาพของตัวอย่าง PCR ตามที่อธิบายไว้ในขั้นตอนต่างๆ 3 และ 4 ของส่วนแรก.

กำลังโหลดเจล

• การใส่เจล:
  • ถอดหวีออกจากเจลทันทีหลังการเกิดพอลิเมอไรเซชัน.
  • ตรวจสอบให้แน่ใจว่ามีการใช้แรงสม่ำเสมอเพื่อรักษาความสมบูรณ์ของหลุม.
  • ยึดแผ่นเจลไว้บนเครื่องอิเล็กโตรโฟรีซิสโดยให้ด้านของหลุมหันเข้าด้านใน.
  • วางแผ่นเจลลงบนบัฟเฟอร์อิเล็กโตรโฟรีซิสอย่างช้าๆ เพื่อหลีกเลี่ยงฟองอากาศขนาดใหญ่.
• ก่อนอิเล็กโตรโฟรีซิส:
  • เติมบัฟเฟอร์อิเล็กโตรโฟรีซิส 1 × TBE ลงในอ่างเก็บน้ำด้านบน จนกระทั่งระดับของเหลวอยู่เหนือขอบด้านสั้นของแผ่นกระจกประมาณ 1 ซม..
  • ตรวจสอบให้แน่ใจว่าไม่มีการรั่วไหลจากอ่างเก็บน้ำด้านบน.
  • ตั้งแรงดันไฟฟ้าไว้ที่ 140-150V สำหรับอุปกรณ์ขนาดใหญ่ และ 110-120V สำหรับอุปกรณ์ขนาดเล็ก.
  • Pre-electrophoresis ประมาณ 10 นาที.
• กำลังโหลดตัวอย่าง:
  • เติมตัวอย่างที่เตรียมไว้ตามลำดับลงในหลุมของเจลโดยใช้ไมโครไซรินจ์.
  • หลีกเลี่ยงการบรรจุตัวอย่างลงในสองหลุมที่อยู่ใกล้กับขอบของแผ่นเจลแต่ละแผ่นมากที่สุด.
• อิเล็กโทรโฟเรซิส:
  • ตั้งแรงดันไฟฟ้าไว้ที่ 140-150V สำหรับอุปกรณ์ขนาดใหญ่ และ 110-120V สำหรับอุปกรณ์ขนาดเล็ก.
  • ดำเนินการอิเล็กโทรโฟเรซิสที่อุณหภูมิ 10-15°C เป็นเวลาอย่างน้อย 10 ชั่วโมง.

การย้อมสี

• การตรึง:
  • นำเจลออกจากอุปกรณ์, ทำเครื่องหมายจุดเริ่มต้น, และจุ่มมันลงไป 70% เอทานอลสำหรับ 15 นาทีบนเชคเกอร์.
  • คืนเอทานอลหลังจากการตรึงและล้างด้วยน้ำกลั่นสองครั้งประมาณ 3 นาทีต่อการล้าง.
• การย้อมสี:
  • ย้อมเจลในสารละลายย้อมสี (200มล 3.6% นาโอห์ 4.2มล, 20% แอคโน3 3.6มล, แอมโมเนีย 2 มล) สำหรับ 30 นาที.
  • ปรับเวลาการย้อมสีหากย้อมเจลสองตัวพร้อมกัน.
• กำลังพัฒนา:
  • พัฒนาเจลในการพัฒนาสารละลาย (200มล 1% โซเดียมซิเตรต 1 มล, ฟอร์มาลดีไฮด์ 100ul) จนกระทั่งมองเห็นแถบได้ชัดเจน.
  • ล้างด้วยน้ำกลั่นสามครั้ง 3 แต่ละนาทีเพื่อหยุดการพัฒนา.
  • อีกทางหนึ่ง, เปื้อนเจลโดยการแช่ในบัฟเฟอร์ 1 × TBE ที่ประกอบด้วยเอทิเดียมโบรไมด์ 0.5ug/ml สำหรับ 10 นาทีและเห็นภาพภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต

สูตร

10×สูตร TBE:

• ฐานทริส: 108ก
• กรดบอริก: 55ก
• 0.5โมล/ลิตร EDTA (ค่า pH 8.0), ปรับปริมาตรเป็น 1 ลิตร

สูตรบัฟเฟอร์เสียสภาพ:

• 98% ฟอร์มาไมด์ปราศจากไอออน
• 10มิลลิโมล/ลิตร EDTA (ค่า pH 8.0)
• 0.025% ไซลีน ไซยานอล FF
• 0.025% โบรโมฟีนอล บลู

หมายเหตุ:

1. ความสามารถในการทำซ้ำ:
   • การรักษาแรงดันไฟฟ้าและอุณหภูมิให้คงที่ในระหว่างการอิเล็กโตรโฟรีซิสเป็นปัจจัยหลักที่ส่งผลต่อความสามารถในการทำซ้ำของ SSCP.
   • โดยทั่วไป, รูปแบบ SSCP แสดงแถบ DNA เส้นเดี่ยวสองแถบ, แต่บางครั้งอาจมีวงดนตรีหนึ่งหรือสามวงขึ้นไปปรากฏขึ้น, อาจเนื่องมาจากการมีอยู่ของโครงสร้างสามมิติที่คล้ายคลึงกันระหว่างชิ้นส่วน DNA แบบไวด์และกลายพันธุ์.
2. อิทธิพลของความยาวลำดับดีเอ็นเอเป้าหมาย:
   • SSCP มีอัตราการตรวจจับที่สูงกว่าสำหรับการกลายพันธุ์ของจุดใน DNA สายสั้นหรือ RNA เมื่อเปรียบเทียบกับ DNA สายยาว. อาจเป็นเพราะการเปลี่ยนแปลงฐานแต่ละฐานในโมเลกุล DNA และ RNA สายโซ่ยาวมีผลน้อยกว่าในการรักษาโครงสร้างสามมิติ.
   • ในกรณีของสาย DNA ที่สั้นกว่า (ต่ำกว่า 400bp), ความยาวของ DNA ไม่ส่งผลต่อประสิทธิผลของ SSCP.
3. ผลของแรงดันและอุณหภูมิอิเล็กโตรโฟรีซิส:
   • เพื่อรักษาโครงสร้างสามมิติที่มั่นคงของ DNA สายเดี่ยว, SSCP ควรทำที่อุณหภูมิต่ำกว่า (โดยทั่วไปอยู่ระหว่าง 4°C ถึง 15°C).
   • ระหว่างอิเล็กโทรโฟรีซิส, แรงดันไฟฟ้าที่มากเกินไปอาจทำให้อุณหภูมิเพิ่มขึ้นได้. ดังนั้น, เมื่อดำเนินการ SSCP ในถังอิเล็กโตรโฟรีซิสโดยไม่มีอุปกรณ์ทำความเย็น, แรงดันไฟฟ้าที่สูงขึ้น (250วี) ควรใช้ตั้งแต่แรก, ตามด้วยการลดลงเหลือประมาณ 100V สำหรับอิเล็กโตรโฟรีซิส.
4. การตีความผลลัพธ์ SSCP:
   • ในการวิเคราะห์ SSCP, การแยกชิ้นส่วน DNA ที่เป็นเกลียวเดี่ยวนั้นขึ้นอยู่กับขนาดของสิ่งกีดขวาง steric มากกว่าน้ำหนักโมเลกุล, จึงไม่สามารถสะท้อนน้ำหนักโมเลกุลได้.
   • การตีความผลลัพธ์ควรขึ้นอยู่กับขีดจำกัดการตรวจจับ, ซึ่งหมายถึงความแตกต่างขั้นต่ำของระยะห่างระหว่างอิเล็กโตรโฟเรติกระหว่างชิ้นส่วนดีเอ็นเอกลายพันธุ์และปกติที่สามารถแยกแยะได้.
5. ข้อควรพิจารณาอื่น ๆ:
   • เงื่อนไขเช่นจำนวนผลิตภัณฑ์ PCR ที่โหลด, ความหนาแน่นของการเชื่อมขวางของโพลีอะคริลาไมด์เจล, และควรเลือกและกำหนดความเข้มข้นของเจลตามเงื่อนไขการทดลองเฉพาะ.