การแนะนำ
- AFLP เป็นเทคโนโลยีเครื่องหมายโมเลกุลดีเอ็นเอที่ตรวจพบ DNA polymorphism โดยการจำกัดความยาวของชิ้นส่วนที่เกิดจากการ จำกัด endonucleases.
- ลักษณะหลักของเทคนิค AFLP คือ:
- ต้องใช้ DNA จำนวนเล็กน้อยสำหรับการวิเคราะห์, เพียง 0.5 กรัม.
- จัดแสดงการทำซ้ำที่ดี.
- แสดงให้เห็นถึงความหลากหลายที่แข็งแกร่ง.
- ให้ความละเอียดสูง.
- ไม่จำเป็นต้องมีการผสมพันธุ์ใต้.
- เหมาะสำหรับตัวอย่างที่หลากหลาย.
- จัดแสดงการถ่ายทอดทางพันธุกรรมที่มั่นคง.
- ในแง่ของคุณสมบัติทางเทคนิค, AFLP เป็นผลิตภัณฑ์ที่รวม RAPD และ RFLP.
- มันเอาชนะข้อเสียของความซับซ้อนและอันตรายจากกัมมันตภาพรังสีของเทคโนโลยี RFLP, และความไม่แน่นอนและการครอบงำของเครื่องหมายทางพันธุกรรมใน RAPD ในขณะที่รวมจุดแข็งของทั้งคู่.
- ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา, เทคโนโลยีนี้ได้รับการปรับปรุงและพัฒนาอย่างต่อเนื่อง, การทำให้ AFLP กลายเป็นวิธีโมเลกุลที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดจนถึงปัจจุบัน.
หลักการของ AFLP
- AFLP ยังเป็นเทคโนโลยีเครื่องหมายโมเลกุลดีเอ็นเอที่ตรวจพบ DNA polymorphism โดยการจำกัดความยาวของชิ้นส่วนที่เกิดจากการ จำกัด endonucleases.
- อย่างไรก็ตาม, AFLP เกี่ยวข้องกับการขยายชิ้นส่วนของเอนไซม์ตัดผ่าน พีซีอาร์ ปฏิกิริยาแรก, และจากนั้นอิเล็กโทรโฟยการขยายชิ้นส่วนของเอนไซม์ที่ถูกขยายออกไปบนเจลลำดับความละเอียดสูง. ตรวจพบความหลากหลายตามความยาวที่แตกต่างกันของชิ้นส่วนขยาย.
- ในการทดลอง, ชิ้นส่วนที่ตัดเอนไซม์จะถูกเชื่อมต่อกับอะแดปเตอร์เทียมเป็นครั้งแรกที่มีปลายเหนียวที่เข้ากันได้. ลำดับของปลายที่เหนียวแน่นเหล่านี้, พร้อมกับลำดับอะแดปเตอร์, ทำหน้าที่เป็นไซต์ที่มีผลผูกพันสำหรับปฏิกิริยา PCR ที่ตามมา.
- ขึ้นอยู่กับข้อกำหนด, ไพรเมอร์ที่แตกต่างกันด้วย 1 ถึง 3 การเลือกนิวคลีโอไทด์ที่เพิ่มที่ปลายสามารถใช้เพื่อให้ได้การขยายแบบเลือก. นิวคลีโอไทด์ที่เลือกเหล่านี้ช่วยให้ไพรเมอร์สามารถรับรู้ชิ้นส่วนที่ตัดเอนไซม์ได้ด้วยลำดับการจับคู่ที่เฉพาะเจาะจง, นำไปสู่การขยายเฉพาะ.
น้ำยาที่ใช้ในการทดสอบ
| รีเอเจนต์ทดลอง | คำอธิบาย |
|---|---|
| เอนไซม์ TAQ | ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส |
| อะแดปเตอร์ Ecori/MSEI | ข้อ จำกัด ของเอนไซม์อะแดปเตอร์ |
| e+a ไพรเมอร์ | ไพรเมอร์สำหรับการขยาย PCR |
| M+C ไพรเมอร์ | ไพรเมอร์สำหรับการขยาย PCR |
| T4 DNA ligase | เอนไซม์ DNA ligase |
| E และ M oligonucleotides | oligonucleotides สำหรับ PCR |
| agarose | เจลเมทริกซ์สำหรับอิเล็กโทรโฟเรซิส |
| แอมโมเนียมเปอร์ซัลเฟต | ตัวเร่งปฏิกิริยาสำหรับการหล่อเจลและการสูญเสีย DNA |
| อะคริลาไมด์ | ส่วนประกอบของเมทริกซ์เจลสำหรับการเรียงลำดับความละเอียดสูง |
| ยูเรีย | ตัวแทน denaturing สำหรับ electrophoresis |
| ซิลเวอร์ไนเตรต | รอยเปื้อนสำหรับการมองเห็นแถบดีเอ็นเอ |
| รูปแบบ | ตัวแทน denaturing สำหรับเจลลำดับดีเอ็นเอ |
| dNTP | deoxynucleotide triphosphates สำหรับ PCR |
| ไซยาน | การติดตามสีย้อมสำหรับอิเล็กโทรโฟเรซิส |
| กรดอะซิติก | ใช้ในการเตรียมเจล |
| ไซเลนแก้ว | สารเคลือบผิวสำหรับแผ่นแก้วในเจลอิเล็กโทรโฟเรซิส |
| 50เครื่องหมาย BP | เครื่องหมายดีเอ็นเอของ 50 คู่ฐานสำหรับการอ้างอิงขนาด |
ขั้นตอนการทดลอง
1. การสกัดดีเอ็นเอจีโนมและการทำให้บริสุทธิ์
อ้างถึงวิธีการสกัดดีเอ็นเอ.
- อิเล็กโทรโฟเรซิสของชิ้นส่วนดีเอ็นเอในก 0.8% เจลอะกาโรส (มี ethidium bromide 0.5μg/ml, อีบี), ออกนอกลู่นอกทาง 1/3 ของ DNA จีโนมสกัดเพื่อการทำให้บริสุทธิ์.
- ประการแรก, เติมเต็มปริมาตรของ DNA ที่สกัดด้วยบัฟเฟอร์ TE เป็นปริมาตรทั้งหมด 50 ไมโครลิตร.
- สกัดหนึ่งครั้งด้วยแอลกอฮอล์ฟีนอล/คลอโรฟอร์ม/ไอโซอะ (25:24:1) และครั้งเดียวกับแอลกอฮอล์คลอโรฟอร์ม/isoamyl (24:1). เครื่องหมุนเหวี่ยงและถ่ายโอนส่วนเหนือไปยังหลอด eppendorf.
- เพิ่ม 1/10 ปริมาณของ NAAC และปริมาณเอทานอลสัมบูรณ์ที่ระบายความร้อนล่วงหน้าสองเท่า, และวางที่ -20 ° C เป็นอย่างน้อย 2 ชั่วโมง. เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 กรัมสำหรับ 10 นาที.
- ล้าง DNA ตกตะกอนสองครั้งด้วย 70% เอทานอล, อากาศแห้ง, และละลายใน 30 μl TE บัฟเฟอร์.
- วัดค่า A260 และ A280 โดยใช้ UV-2401PC (ชิมาดูซู) UV spectrophotometer สำหรับการหาปริมาณ.
- อิเล็กโทรโฟเรซิสของชิ้นส่วนดีเอ็นเอในก 0.8% เจลอะกาโรส (มี0.5μg/ml EB) สำหรับการกำหนดขนาด.
บันทึก:
- สำหรับเนื้อเยื่อ 0.1-0.2 กรัม, ละลายในสารละลาย100μl E. สำหรับเนื้อเยื่อ 0.5 กรัม, เพิ่มโซลูชัน e เป็น300μl. ณ จุดนี้, ความเข้มข้นของดีเอ็นเออยู่ที่ประมาณ 100ng/μl.
2. ข้อ จำกัด ของเอนไซม์การย่อยอาหารและ ligation
ในหลอดเซนติเมตร 0.2ml, เพิ่ม:
- DNA เทมเพลตประมาณ 250ng,
- 2.5μl 10 ×ข้อ จำกัด เอนไซม์ย่อยสลายบัฟเฟอร์,
- 2.5μl 10 × T4 DNA ligase buffer,
- 5 หน่วย Ecori,
- 5 หน่วย MSEI,
- 2 หน่วยของ T4 DNA ligase,
- 50อะแดปเตอร์ PMOL MSEI,
- น้ำกลั่นสองเท่าถึงปริมาตรทั้งหมด25μl.
บ่มส่วนผสมในชุดเทอร์โมไซเลอร์ PCR ที่อุณหภูมิ 37 ° C ค้างคืน. หลังการย่อยอาหาร, ยับยั้งเอนไซม์โดยการฟักตัวที่ 65 ° C สำหรับ 20 นาที. เก็บปฏิกิริยาที่ -20 ° C เพื่อใช้เพิ่มเติมเป็นเทมเพลตการขยายล่วงหน้า.
3. การขยายล่วงหน้า
ใช้ผลิตภัณฑ์3μLของเอนไซม์ที่ย่อยและเพิ่มขึ้นและเพิ่ม:
- 75ของ E+a primer,
- 75ของ M+C ไพรเมอร์,
- 15mm mg2+,
- 25mm dntps,
- 1 หน่วยของ แท็คโพลีเมอเรส,
- 3μlบัฟเฟอร์ 10 × PCR,
- เพิ่มน้ำกลั่นสองเท่าลงในปริมาตรรวม30μl.
ตั้งค่าพารามิเตอร์ปฏิกิริยา PCR ดังนี้:
- การสูญเสียสภาพเริ่มต้นที่ 94 ° C สำหรับ 90 วินาที,
- การสูญเสียสภาพที่ 94 ° C สำหรับ 30 วินาที,
- การหลอมที่ 56 ° C สำหรับ 1 นาที,
- ส่วนขยายที่ 72 ° C สำหรับ 1 นาที,
- ทำซ้ำขั้นตอนข้างต้นสำหรับ 30 รอบ,
- ส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C สำหรับ 10 นาที (ใช้ไฟล์ เครื่องพีซีอาร์ จาก บริษัท PE).
หลังจากเกิดปฏิกิริยา, วิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ขยายโดยอิเล็กโทรโฟเรซิสบนก 0.8% เจลอะกาโรส (มี0.5μg/ml EB). ใช้ผลิตภัณฑ์3μLและเจือจาง 50 เวลาสำหรับการใช้งานเพิ่มเติมเป็นเทมเพลตสำหรับการขยายแบบเลือก.
4. การขยาย PCR แบบเลือก
ใช้ผลิตภัณฑ์ที่เจือจาง3μLและเพิ่ม:
- 75ของecorⅰไพรเมอร์ที่เลือก,
- 75ของMSEⅰไพรเมอร์ที่เลือก,
- 15mm mg2+,
- 25mm dntps,
- 1 หน่วยของ TAQ polymerase,
- 3μlบัฟเฟอร์ 10 × PCR,
- เพิ่มน้ำกลั่นสองเท่าลงในปริมาตรรวม30μl.
ตั้งค่าพารามิเตอร์ปฏิกิริยา PCR ดังนี้:
- การสูญเสียสภาพเริ่มต้นที่ 94 ° C สำหรับ 90 วินาที,
- การสูญเสียสภาพที่ 94 ° C สำหรับ 30 วินาที,
- การหลอมที่ 65 ° C สำหรับ 1 นาที, จากนั้นแสดง 13 รอบ (ลดอุณหภูมิลง 0.7 ° C ต่อรอบ),
- การสูญเสียสภาพที่ 94 ° C สำหรับ 30 วินาที,
- การหลอมที่ 56 ° C สำหรับ 1 นาที,
- ส่วนขยายที่ 72 ° C สำหรับ 1 นาที, จากนั้นแสดง 25 รอบ,
- ส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C สำหรับ 5 นาที (ใช้เครื่อง PCR จาก บริษัท PE).
อันดับแรก, วิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ของการขยายแบบเลือกโดยอิเล็กโทรโฟเรซิสบนก 0.8% เจลอะกาโรส (มี0.5μg/ml EB).
5. เจลอิเล็กโทรโฟเรซิส
แยกผลิตภัณฑ์ที่ขยายออกโดยใช้ไฟล์ 6% denaturing polyacrylamide gel (0.5มม. หนา) และบัฟเฟอร์อิเล็กโทรโฟเรซิส 1 × TBE (Bio-Rad Sequencing Electrophoresis อุปกรณ์).
- ลบหวีและรันเจลล่วงหน้าด้วยกำลังคงที่ 140W สำหรับ 30 นาทีจนถึงอุณหภูมิถึง 47-49 ° C. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้ล้างยูเรียจากแต่ละหลุม.
- สำหรับผลิตภัณฑ์ขยายที่เลือก, เพิ่มปริมาณการโหลดบัฟเฟอร์เท่ากัน (98% ฟอร์มาไมด์, 10เอ็มเอ็ม เอ็ดต้า, 0.25% ไซยาน, 0.25% โบรโมฟีนอลสีน้ำเงิน) และ denature ที่ 94 ° C สำหรับ 5 นาที (ใช้เครื่อง PCR จาก บริษัท PE). หลังจากการเสียสภาพ, วางบนน้ำแข็งอย่างรวดเร็วจนโหลด.
- โหลด8μlของแต่ละตัวอย่างลงในแต่ละเลน. เริ่มแรก, รันเจลด้วยกำลังคงที่ 100W เป็นเวลาประมาณ 2 นาทีเพื่อให้ความสนใจอย่างรวดเร็วตัวอย่างที่ด้านล่างของบ่อน้ำ. จากนั้นปรับให้เข้ากับกำลังคงที่ 60W, รักษาอุณหภูมิประมาณ 43 ° C, จนกระทั่ง bromophenol blue ถึงประมาณ 2/3 ระยะทางจากด้านบนของเจลไปจนถึงแผ่นแก้ว. สิ้นสุดอิเล็กโทรโฟเรซิส.
6. การย้อมสีเงิน
- โซลูชันการตรึง: เพิ่มกรดอะซิติกน้ำแข็ง 100 มล. ลงในน้ำที่ปราศจากไอออน 900 มล. หรือน้ำสองชั้น.
- วิธีแก้ปัญหาการย้อมสี: ละลาย 1G Agno3 ในน้ำที่ปราศจากไอออน 1L, จากนั้นเพิ่ม 1.5 มล. 37% ฟอร์มาลดีไฮด์.
- การพัฒนาโซลูชัน: ละลาย 30g Na2Co3, 1.5 มล. 37% ฟอร์มาลดีไฮด์, และโซเดียมไธโอซัลเฟต 2 มก. ในน้ำที่ปราศจากไอออน 1L.
- หลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิส, วางแผ่นแก้วด้วยเจลลงในถาดพลาสติกเพื่อการย้อมสีเงิน.
- การตรึง: เพิ่มโซลูชันการตรึงและเขย่าเครื่องปั่นเบา ๆ 30 นาที. จองโซลูชันการตรึงหลังการตรึง.
- การล้าง: ล้างเจลสามครั้งด้วยน้ำปราศจากไอออน 2 นาทีในแต่ละครั้ง.
- การย้อมสี: วางเจลลงในถาดย้อมสีและเทลงในสารละลายการย้อมสี (เก็บไว้ที่ 4 ° C). ค่อยๆเขย่าเครื่องปั่น 30 นาที. หลังจากล้างเจลด้วยน้ำที่ปราศจากไอออน 10 วินาที, โอนไปยังถาดพัฒนา.
- การพัฒนา: เพิ่มโซลูชันการพัฒนา (เก็บไว้ที่ 4 ° C) และเขย่าเบา ๆ จนกระทั่งวงหยุดเพิ่มขึ้น.
- การเลิก: เพิ่มโซลูชันการตรึงที่ใช้แล้วจากขั้นตอน 2 และปั่นป่วนสักสองสามนาที. ล้างออกด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลาหลายนาทีเมื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุดบรรลุผล.
- หลังจากเอาหยดน้ำออกจากเจลและแผ่นแก้ว, วางไว้บน Lightbox และถ่ายภาพโดยใช้กล้องดิจิตอล Nikon.
สรุป
ขอขอบคุณที่ให้ขั้นตอนการทดลอง AFLP ที่สมบูรณ์! หากคุณมีคำถามใด ๆ หรือต้องการความช่วยเหลือเพิ่มเติม, โปรดอย่าลังเลที่จะถามเรา. เรายินดีให้การสนับสนุนและคำตอบ.
