ความแตกต่างระหว่าง PCR และ PCR แบบเรียลไทม์คืออะไร ?

การแนะนำ

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (พีซีอาร์) ปฏิวัติการวิจัยทางการแพทย์เมื่อมีการคิดค้นในช่วงทศวรรษ 1980. เทคนิคนี้ใช้ประโยชน์จากกระบวนการจำลองดีเอ็นเอตามธรรมชาติเพื่อขยายลำดับทางพันธุกรรมจำเพาะอย่างรวดเร็วสำหรับการศึกษาต่อไป. PCR เปิดโอกาสใหม่สำหรับการวิจัยทางพันธุศาสตร์และการวินิจฉัยทางคลินิก.

PCR รูปแบบขั้นสูงที่เรียกว่า PCR แบบเรียลไทม์, สร้างขึ้นภายหลังจากการค้นพบนี้. PCR แบบเรียลไทม์มีความสามารถเพิ่มเติมที่ทำให้เหมาะสำหรับบางแอปพลิเคชันที่ PCR มาตรฐานล้มเหลว.

การทำความเข้าใจว่าเมื่อใดควรใช้แต่ละวิธีช่วยให้นักวิจัยเพิ่มประสิทธิภาพการทดลองและแพทย์เพื่อให้การดูแลผู้ป่วยได้ดียิ่งขึ้น.

PCR แบบดั้งเดิมคืออะไร และเหตุใดจึงสำคัญ？

Kary Mullis ค้นพบ PCR เป็นครั้งแรกขณะขับรถไปตามทางหลวงที่มีแสงจันทร์. เทคนิคที่ได้รับรางวัลโนเบลนี้ใช้ประโยชน์จากกระบวนการจำลองดีเอ็นเอตามธรรมชาติเพื่อขยายลำดับพันธุกรรมเป้าหมายในหลอดทดลองแบบทวีคูณ.

PCR ช่วยให้นักวิทยาศาสตร์สามารถศึกษาตัวอย่างทางพันธุกรรมขนาดเล็กที่ไม่สามารถตรวจพบได้ด้วยวิธีอื่น. อีกทั้งยังให้ความรวดเร็ว, ทางเลือกที่เหมาะสมแทนการทดลองโคลน DNA ซึ่งครั้งหนึ่งเคยใช้เวลาหลายสัปดาห์หรือหลายเดือน.

PCR แบบดั้งเดิมทำงานอย่างไร？

PCR ประกอบด้วยวงจรอุณหภูมิซ้ำๆ เพื่ออำนวยความสะดวกในการทำลาย DNA, ไพรเมอร์หลอม, และการขยายลำดับโดย DNA polymerase ที่คงความร้อนได้. หลังจาก 30-40 รอบ, มีสำเนาเพียงพอสำหรับการวิเคราะห์และแอปพลิเคชันดาวน์สตรีม.

กระบวนการนี้เกี่ยวข้องกับสามขั้นตอนสำคัญ:

● การเสียสภาพ: การให้ความร้อนจะแยกเกลียวคู่ของ DNA ออกเป็นเกลียวเดี่ยว
● การหลอม: การระบายความร้อนช่วยให้ไพรเมอร์จับกับลำดับเสริมของพวกมันได้
● ส่วนขยาย: DNA polymerase สังเคราะห์เส้นใยใหม่โดยใช้ไพรเมอร์

จากนั้นจึงทำซ้ำวงจร, โดยมีจำนวนสำเนา DNA เป้าหมายเพิ่มขึ้นประมาณสองเท่าในแต่ละรอบ. หลังจาก 30+ รอบ, มีมากกว่าพันล้านเล่ม.

คุณสามารถใช้ PCR แบบดั้งเดิมเพื่ออะไรได้บ้าง?

PCR เปิดโอกาสใหม่ในการวิจัยทางพันธุกรรมและการวินิจฉัยทางคลินิกเนื่องจากความน่าเชื่อถือ, การปรับตัว, และความเรียบง่าย.

การใช้ PCR นี้ได้แก่:

● การตรวจจับการกลายพันธุ์ทางพันธุกรรม
● การโคลนและการจัดลำดับดีเอ็นเอ
● การวิเคราะห์หลักฐานทางนิติวิทยาศาสตร์
● การวินิจฉัยเชื้อโรคและโรคต่างๆ

PCR แบบดั้งเดิมมีข้อจำกัดอะไรบ้าง?

ในขณะที่ PCR แบบดั้งเดิมจะตรวจจับลำดับเป้าหมายในเชิงคุณภาพ, มันขาดความสามารถในการหาปริมาณ. วิธีการตรวจจับจุดสิ้นสุดเพียงยืนยันการมีอยู่หรือไม่มีการขยายเท่านั้น. นักวิจัยขาดเครื่องมือในการวัดตัวบ่งชี้ทางชีวภาพเชิงปริมาณสำหรับการใช้งานในลักษณะนี้:

● การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แม่นยำ
● ตรวจหาโรคตกค้างน้อยที่สุดในมะเร็ง
● การติดตามปริมาณไวรัสของการติดเชื้อ
● การคัดกรองทางพันธุกรรมที่มีปริมาณงานสูง

PCR แบบเรียลไทม์คืออะไร และได้รับการพัฒนาเมื่อใด?

PCR แบบเรียลไทม์, เรียกอีกอย่างว่า PCR เชิงปริมาณ (คิวพีซีอาร์), ในที่สุดก็นำความสามารถในการวัดปริมาณ DNA ที่สมบูรณ์มาสู่ PCR ในช่วงต้นทศวรรษ 1990.

เครื่องมือพิเศษจะตรวจจับการเรืองแสงจากสีย้อมที่จับกับ DNA หรือโพรบเฉพาะลำดับในแต่ละรอบอุณหภูมิ. ซอฟต์แวร์นี้จะสร้างแผนการขยายสัญญาณแบบเรียลไทม์ซึ่งใช้ในการระบุปริมาณ DNA เริ่มต้นอย่างแม่นยำ.

PCR แบบเรียลไทม์ทำงานอย่างไร?

PCR แบบเรียลไทม์รวมเอาสีย้อมรีพอร์ตเตอร์เรืองแสงหรือโพรบเฉพาะลำดับเพื่อให้สามารถหาปริมาณ DNA ในระหว่างการขยาย. ขั้นตอนสำคัญคือ:

● ฉลากฟลูออเรสเซนต์แทรกหรือผสมกันเพื่อขยาย DNA
● เครื่องมือพิเศษจะตรวจจับการเรืองแสงในแต่ละรอบ
● ซอฟต์แวร์จะสร้างแปลงขยายสัญญาณ
● การวิเคราะห์เชิงปริมาณจะคำนวณระดับ DNA เริ่มต้นที่แน่นอน
ดังนั้นโดยการตรวจสอบการเรืองแสงตลอดกระบวนการขยายสัญญาณเอ็กซ์โพเนนเชียล, PCR แบบเรียลไทม์อำนวยความสะดวกในการตรวจจับเชิงปริมาณที่มีความละเอียดอ่อน.

มันมีข้อดีอะไรบ้าง?

ในขณะที่ PCR มาตรฐานจะตรวจจับลำดับทางพันธุกรรมในเชิงคุณภาพ, PCR แบบเรียลไทม์ระหว่างการขยายจะระบุปริมาณเริ่มต้นผ่านการเรืองแสง.

ความแตกต่างที่สำคัญนี้ทำให้ PCR แบบเรียลไทม์เหมาะสำหรับ:

● วัดการแสดงออกของยีนได้อย่างแม่นยำ
● ตรวจหาโรคตกค้างขั้นต่ำ
● การตรวจสอบโหลดไวรัส
● การตรวจคัดกรองเพื่อวินิจฉัย
● การวิเคราะห์ทางพันธุกรรมที่มีปริมาณงานสูง

PCR แบบเรียลไทม์เปิดใช้งานการตรวจจับเชิงปริมาณได้อย่างไร？

PCR แบบเรียลไทม์อำนวยความสะดวกในการหาปริมาณ DNA ที่แม่นยำผ่านการใช้ระบบนักข่าวเรืองแสงที่โต้ตอบกับสาย DNA ที่กำลังขยาย. มีสองประเภทหลัก:

• สีย้อม DNA แบบไม่จำเพาะ
  สีย้อมเรืองแสงเช่น ซีบีอาร์ สีเขียวสามารถจับและสอดประสานภายใน DNA ที่มีเกลียวคู่ได้. เนื่องจากการขยายสัญญาณดำเนินไปแบบทวีคูณระหว่าง PCR, DNA ที่มีป้ายกำกับมากขึ้นจะสะสมและความเข้มของแสงเรืองแสงจะเพิ่มขึ้นตามสัดส่วน. เครื่องมือพิเศษจะตรวจสอบความเข้มข้นนี้หลังจากแต่ละรอบ. โดยกำหนดวัฏจักรที่การเรืองแสงเกินพื้นหลัง (ซีคิว), ซอฟต์แวร์จะคำนวณปริมาณสัมบูรณ์ของ DNA เริ่มต้น

• โพรบเฉพาะลำดับ
  โพรบเฉพาะลำดับ เช่น โพรบ TaqMan และบีคอนโมเลกุลจะผูกและระบุปริมาณลำดับ DNA เป้าหมายเท่านั้น. โพรบเหล่านี้ประกอบด้วยสีย้อมนักข่าวเรืองแสงและโมเลกุลดับ. เมื่อผูกพันกับเป้าหมายแล้ว, แสงเรืองแสงของนักข่าวดับลง. ระหว่างการขยายเสียง, กิจกรรมของโพลีเมอเรสจะปล่อยโพรบออกมา, แยกนักข่าวออกจากเครื่องดับและเปล่งแสงเรืองแสง.

PCR แบบเรียลไทม์ดีกว่า PCR แบบดั้งเดิมอย่างไร?

PCR แบบเรียลไทม์ปรับปรุงตามความไวของ PCR แบบดั้งเดิม, ความจำเพาะ, และความเร็ว:

● วัดปริมาณระดับ DNA เริ่มต้นผ่านการเรืองแสง
● เพิ่มความไวและความแม่นยำ
● ระยะเวลาถึงผลลัพธ์เร็วขึ้นโดยไม่ต้องมีขั้นตอนหลัง PCR
● ปริมาณงานที่สูงขึ้นด้วยเพลตแบบหลายหลุม
● ระบบอัตโนมัติช่วยเพิ่มความสามารถในการทำซ้ำ

ดังนั้นสำหรับการใช้งานใดๆ ที่ต้องการการหาปริมาณที่ละเอียดอ่อนหรือการวิเคราะห์อย่างรวดเร็ว, rt PCR เหนือกว่า PCR ทั่วไป.

การเปรียบเทียบ PCR แบบดั้งเดิมและ PCR แบบเรียลไทม์

นี่คือการเปรียบเทียบระหว่าง PCR แบบดั้งเดิมกับ PCR แบบเรียลไทม์ ที่สามารถช่วยคุณตัดสินใจระหว่าง PCR แบบดั้งเดิมและ PCR แบบเรียลไทม์ :

แพทย์ส่วนใหญ่แนะนำอะไรระหว่าง PCR แบบดั้งเดิมกับ PCR แบบเรียลไทม์?

PCR ทั้งแบบมาตรฐานและแบบเรียลไทม์ได้ปฏิวัติการวิจัยและการวินิจฉัยโดยเปิดใช้งานการวิเคราะห์ทางพันธุกรรมที่มีความละเอียดอ่อน. อย่างไรก็ตาม, นักวิทยาศาสตร์และแพทย์จำนวนมากแนะนำให้ใช้ rt PCR มากกว่า PCR แบบดั้งเดิมสำหรับการใช้งานที่ต้องการ:

● การหาปริมาณสัมบูรณ์ของระดับ DNA
● ผลลัพธ์ที่รวดเร็วในสถานพยาบาล
● ความสามารถในการทดสอบปริมาณงานสูง
● ความไวในการตรวจจับสูงสุด

สำหรับการตรวจจับเชิงคุณภาพ, PCR แบบดั้งเดิมเป็นวิธีที่ดีที่สุด. แต่การวัดปริมาณและความเร็วที่แม่นยำของ rt PCR ทำให้เป็นเครื่องมือสำคัญในการวิจัยทางพันธุศาสตร์และการวินิจฉัยระดับโมเลกุล.

ความคิดสุดท้าย

ในขณะที่ทั้งสองวิธีมีการขยาย DNA ที่ละเอียดอ่อนและเฉพาะเจาะจง, PCR แบบเรียลไทม์มีความสามารถเพิ่มเติม เช่น การหาปริมาณสัมบูรณ์, ปริมาณงานที่สูงขึ้น, ความเร็วที่เพิ่มขึ้น, และความไวที่ทำให้เหมาะสำหรับการใช้งานบางอย่างในการวิจัยและการวินิจฉัยระดับโมเลกุล. ตัวเลือกจะขึ้นอยู่กับความจำเป็นในการหาปริมาณเทียบกับการตรวจจับเชิงคุณภาพอย่างง่ายเป็นหลัก.