การพัฒนาเทคโนโลยี PCR
- ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (พีซีอาร์) เป็นเทคนิคชีววิทยาโมเลกุลที่ใช้ในการขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจง.
- ถือได้ว่าเป็นการจำลองแบบดีเอ็นเอชนิดพิเศษที่เกิดขึ้นนอกสิ่งมีชีวิต.
- DNA polymerase ฉันถูกค้นพบครั้งแรก 1955.
- ชิ้นส่วน Klenow ของ E. โคไล, ค้นพบในต้นปี 1970 โดยดร.. ชม. Klenow, มีค่าการทดลองและการปฏิบัติจริง.
- อย่างไรก็ตาม, เอนไซม์นี้ไม่ทนความร้อนและ denatures ที่อุณหภูมิสูง, ทำให้ไม่เหมาะสมสำหรับการใช้ใน PCR ที่ต้องใช้การสูญเสียอุณหภูมิสูง.
- เอนไซม์ที่ใช้กันทั่วไปในปัจจุบัน, เรียกว่าเป็น แท็คโพลีเมอเรส, ถูกแยกออกจากแบคทีเรีย thermus aquaticus ใน 1976.
- ลักษณะของความต้านทานความร้อนทำให้เป็นเอนไซม์ในอุดมคติ, แต่การใช้อย่างแพร่หลายเกิดขึ้นหลังจากปี 1980.
- แนวคิดดั้งเดิมของ PCR, คล้ายกับการจำลองการซ่อมแซมยีน, ถูกเสนอโดยดร.. Kjell Kleppe ใน 1971.
- เขาตีพิมพ์การทดลองครั้งแรกของการจำลองยีนที่บริสุทธิ์และชั่วคราว (คล้ายกับสองรอบแรกของ PCR).
- PCR ที่พัฒนาขึ้นในวันนี้ได้รับการบุกเบิกโดยดร.. Kary B. mulles ใน 1983, เมื่อ Mullis ทำงานให้กับ บริษัท PE, ให้ บริษัท มีตำแหน่งพิเศษในสาขา PCR.
- Mullis และ Saiki ตีพิมพ์บทความที่เกี่ยวข้องครั้งแรกอย่างเป็นทางการใน 1985.
- ตั้งแต่นั้นมา, การประยุกต์ใช้ PCR ได้ขยายตัวอย่างรวดเร็ว, และคุณภาพของเอกสารที่เกี่ยวข้องได้ผ่านวิธีการวิจัยอื่น ๆ อีกมากมาย.
- ต่อมา, เทคโนโลยี PCR มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยทางชีวภาพและการใช้งานทางคลินิก, กลายเป็นเทคนิคสำคัญในการวิจัยชีววิทยาโมเลกุล.
- Mullis ได้รับรางวัลโนเบลสาขาวิชาเคมีใน 1993 สำหรับการบริจาคของเขา.
หลักการของ PCR
หลักการพื้นฐานของเทคโนโลยี PCR นั้นคล้ายกับกระบวนการจำลองแบบธรรมชาติของ DNA, และความจำเพาะของมันขึ้นอยู่กับไพรเมอร์ oligonucleotide ที่เสริมตามลำดับเป้าหมายที่ปลายทั้งสอง. PCR ประกอบด้วยสามขั้นตอนการตอบสนองพื้นฐาน: การเสียชีวิต, การหลอม, และส่วนขยาย:
- การเสียชีวิตของ DNA เทมเพลต: หลังจากให้ความร้อน DNA เทมเพลตประมาณ 93 ° C ในช่วงระยะเวลาหนึ่ง, DNA แบบสองเส้นของ DNA เทมเพลตหรือ DNA แบบสองเส้นที่เกิดจากการขยาย PCR ถูกแยกออกจากกัน, ทำให้มันเป็นเส้นเดียวเพื่อให้สามารถผูกกับไพรเมอร์และเตรียมพร้อมสำหรับการตอบสนองรอบต่อไป.
- การหลอม (การเข้าร่วมใหม่) ของเทมเพลต DNA และไพรเมอร์: หลังจาก DNA เทมเพลตถูกทำลายเป็นเส้นเดี่ยว, อุณหภูมิลดลงเหลือประมาณ 55 ° C, และลำดับเสริมของไพรเมอร์และ DNA เทมเพลตเดี่ยวที่มีเส้นเดี่ยวขึ้นและผูก.
- ส่วนขยายของไพรเมอร์: ด้วยการกระทำของ TAQ DNA polymerase, การใช้ DNTPS เป็นสารตั้งต้นปฏิกิริยาและลำดับเป้าหมายเป็นเทมเพลต, ตามหลักการของการจับคู่ฐานเสริมและการจำลองแบบกึ่งอนุรักษ์นิยม, ห่วงโซ่การจำลองแบบกึ่งอนุรักษ์นิยมใหม่เข้ากับห่วงโซ่ DNA ของเทมเพลตถูกสังเคราะห์. ห่วงโซ่นี้สามารถขยายออกเป็นหลายล้านสำเนาของยีนเป้าหมายภายใน 2 ถึง 3 ชั่วโมงโดยการเสียชีวิตซ้ำ, การหลอม, และกระบวนการขยาย.
ระบบปฏิกิริยา PCR และเงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาระบบ PCR มาตรฐาน
| ส่วนประกอบ | ปริมาณ/ความเข้มข้น |
|---|---|
| 10X Amplification Buffer | 10ไมโครลิตร |
| 4 ประเภทของส่วนผสม DNTP | 200ไมโครลิตร |
| ไพรเมอร์ | 10-100ไมโครลิตร |
| แม่แบบดีเอ็นเอ | 0.1-2มก |
| TAQ DNA polymerase | 2.5ไมโครลิตร |
| Mg2+ | 1.5มิลลิโมล/ลิตร |
| น้ำกลั่นสองหรือสาม | 100ไมโครลิตร |
ห้าองค์ประกอบของปฏิกิริยา PCR:
- ไพรเมอร์ (ไพรเมอร์ PCR เป็นชิ้นส่วนดีเอ็นเอ, ในขณะที่ไพรเมอร์สำหรับการจำลองดีเอ็นเอของเซลล์เป็นโซ่ RNA)
- เอนไซม์
- dNTP
- เทมเพลต
- สารละลายบัฟเฟอร์ (ซึ่งต้องใช้ Mg2+)
กระบวนการ PCR มาตรฐานประกอบด้วยสามขั้นตอน:
- การสูญเสีย DNA (90° C-96 ° C): ภายใต้อิทธิพลของความร้อน, พันธะไฮโดรเจนในเทมเพลตดีเอ็นเอที่มีเกลียวสองเส้น, การสร้าง DNA แบบเส้นเดี่ยว.
- การหลอม (25° C-65 ° C): อุณหภูมิของระบบลดลง, อนุญาตให้ไพรเมอร์ผูกกับเทมเพลต DNA, สร้างภูมิภาคที่มีความยาวสองเท่าในท้องถิ่น.
- ส่วนขยาย (70° C-75 ° C): ด้วยการกระทำของ TAQ polymerase (กิจกรรมที่ดีที่สุดประมาณ 72 ° C), การใช้ DNTPS เป็นสารตั้งต้น, ส่วนขยายเกิดขึ้นจาก 5′ จบ 3′ ปลายไพรเมอร์, การสังเคราะห์ DNA Strand เสริมกับเทมเพลต.
หมายเหตุ:
- แต่ละรอบผ่านการสูญเสียสภาพ, การหลอม, และส่วนขยาย, เพิ่มปริมาณ DNA เป็นสองเท่า.
- โปรโตคอล PCR บางตัว, เนื่องจากพื้นที่ขยายระยะสั้น, สามารถทำการจำลองแบบได้แม้ว่ากิจกรรม TAQ polymerase จะไม่เหมาะสมที่สุด.
- ในกรณีเหล่านี้, สามารถใช้วิธีสองขั้นตอนได้, ในกรณีที่การหลอมและการขยายเกิดขึ้นพร้อมกันที่อุณหภูมิระหว่าง 60 ° C และ 65 ° C, ลดจำนวนรอบอุณหภูมิและเพิ่มความเร็วในการตอบสนอง.
ลักษณะปฏิกิริยาของ PCR
ความจำเพาะที่แข็งแกร่ง
ความจำเพาะของปฏิกิริยา PCR ถูกกำหนดโดย:
- การผูกไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงและถูกต้องกับ DNA เทมเพลต.
- หลักการจับคู่ฐาน.
- ความซื่อสัตย์ของปฏิกิริยาการสังเคราะห์พอลิเมอเรส TAQ DNA.
- ความจำเพาะและการอนุรักษ์ยีนเป้าหมาย.
หมายเหตุ:
- การเชื่อมโยงไพรเมอร์กับเทมเพลตที่ถูกต้องเป็นสิ่งสำคัญ.
- การผูกไพรเมอร์กับเทมเพลตและส่วนขยายของโซ่ไพรเมอร์เป็นไปตามหลักการของการจับคู่ฐาน.
- ความเที่ยงตรงของปฏิกิริยาการสังเคราะห์พอลิเมอเรสและความต้านทานความร้อนของ TAQ DNA polymerase ช่วยให้สามารถหลอมได้ (การเข้าร่วมใหม่) ของแม่แบบและไพรเมอร์ที่จะเกิดขึ้นที่อุณหภูมิสูงขึ้น, การเพิ่มความจำเพาะของการผูกและรักษาความแม่นยำในระดับสูงอย่างมากสำหรับกลุ่มเป้าหมายที่ขยายตัว.
- นอกจากนี้, โดยการเลือกภูมิภาคยีนเป้าหมายที่มีความจำเพาะและการอนุรักษ์สูง, ระดับความจำเพาะเพิ่มขึ้นอีก.
ความไวสูง
- ปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR เพิ่มขึ้นแบบทวีคูณ, การเปิดใช้งานการขยายจำนวนเทมเพลตเริ่มต้นจาก picograms (pg = 10^-12) ไปยังไมโครกรัม (μg = 10^-6).
- สามารถตรวจจับเซลล์เป้าหมายจากหนึ่งล้านเซลล์.
- ในการตรวจจับไวรัส, ความไวของ PCR สามารถเข้าถึงได้ 3 RFU (หน่วยสร้าง recombinant), ขณะอยู่ในแบคทีเรียวิทยา, อัตราการตรวจจับขั้นต่ำคือ 3 แบคทีเรีย.
เรียบง่ายและรวดเร็ว
- ปฏิกิริยา PCR ใช้ TAQ DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้.
- เมื่อผสมปฏิกิริยา, การเสียชีวิต, การหลอม, และปฏิกิริยาการขยายจะดำเนินการกับของเหลวขยาย DNA และอ่างน้ำ, โดยทั่วไปแล้วการทำปฏิกิริยาการขยายใน 2 ถึง 4 ชั่วโมง.
- ผลิตภัณฑ์ขยายมักจะวิเคราะห์โดย electrophoresis, โดยไม่จำเป็นต้องใช้ไอโซโทป, ดังนั้นการลดการปนเปื้อนของกัมมันตภาพรังสีและการเผยแพร่สิ่งอำนวยความสะดวก.
ข้อกำหนดความบริสุทธิ์ต่ำสำหรับตัวอย่าง
- ไม่จำเป็นต้องแยกไวรัสหรือแบคทีเรียหรือเซลล์วัฒนธรรม; DNA และ RNA ดิบสามารถใช้เป็นเทมเพลตการขยายได้.
- ตัวอย่างทางคลินิกเช่นเลือด, ของเหลวในร่างกาย, เสมหะ, ผม, เซลล์, และเนื้อเยื่อสดสามารถใช้โดยตรงสำหรับการตรวจจับการขยาย DNA.
การแก้ไขปัญหา PCR
เชิงลบที่ผิดพลาด
การไม่มีแถบการขยายในปฏิกิริยา PCR มักเกิดจากปัจจัยสำคัญ:
เทมเพลตการเตรียมกรดนิวคลีอิก
- สารปนเปื้อนเช่นโปรตีนในเทมเพลต, การปรากฏตัวของสารยับยั้ง TAQ polymerase, การกำจัดโปรตีนที่ไม่สมบูรณ์ (โดยเฉพาะฮิสโตน) จาก DNA โครโมโซม, การสูญเสียมากเกินไปในระหว่างการสกัดเทมเพลต, หรือการสูดดมฟีนอลอาจนำไปสู่ปัญหา.
- การเสียชีวิตที่ไม่สมบูรณ์ของกรดนิวคลีอิกเทมเพลตอาจมีบทบาทเช่นกัน.
- เมื่อคุณสมบัติของเอนไซม์และไพรเมอร์ดี, และแถบขยายไม่ปรากฏขึ้น, อาจเป็นเพราะปัญหาการย่อยตัวอย่างหรือความผิดพลาดในกระบวนการสกัดกรดนิวคลีอิก.
- ควรเตรียมโซลูชันการย่อยอาหารที่มีประสิทธิภาพและมีเสถียรภาพ, และขั้นตอนควรคงที่.
การยับยั้งเอนไซม์
สิ่งนี้อาจจำเป็นต้องเปลี่ยนเอนไซม์ด้วยใหม่หรือใช้การรวมกันของเอนไซม์เก่าและใหม่เพื่อวิเคราะห์ว่าการสูญเสียกิจกรรมของเอนไซม์หรือความไม่เพียงพอทำให้เกิดการลบเท็จ. บางครั้ง, การลืมเพิ่ม TAQ polymerase หรือ ethidium bromide ยังสามารถทำให้เกิดปัญหาได้.
ปัญหาไพรเมอร์
- คุณภาพและความเข้มข้นของไพรเมอร์, สมมาตรของความเข้มข้นของไพรเมอร์, และการแปรผันของแบทช์ในคุณภาพการสังเคราะห์ไพรเมอร์สามารถส่งผลกระทบต่อผลลัพธ์ของ PCR.
- โซลูชันรวมถึงการเลือกหน่วยการสังเคราะห์ไพรเมอร์ที่มีชื่อเสียง, ยืนยันความเข้มข้นของไพรเมอร์ผ่านอิเล็กโทรโฟเรซิสเจล agarose, สร้างความมั่นใจในความเข้มของวงดนตรีที่คล้ายกันสำหรับไพรเมอร์ทั้งสอง, การจัดเก็บไพรเมอร์ที่ระดับความเข้มข้นสูงในส่วนที่มีขนาดเล็กเพื่อป้องกันการย่อยสลาย, และสร้างความมั่นใจในการออกแบบไพรเมอร์ที่มีเหตุผลเพื่อป้องกันปัญหาเช่นการสร้างไพรเมอร์หรี่.
ความเข้มข้นของ Mg2+
ความเข้มข้นของ Mg2+ ไอออนมีผลต่อประสิทธิภาพการขยาย PCR อย่างมีนัยสำคัญ. ความเข้มข้นที่มากเกินไปหรือไม่เพียงพออาจส่งผลต่อความจำเพาะหรือผลผลิต, นำไปสู่การขยายที่ล้มเหลว.
การเปลี่ยนแปลงปริมาณปฏิกิริยา
ปริมาตร PCR มักจะอยู่ในช่วงตั้งแต่20μlถึง100μl, ขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์. ควรปรับปริมาณการเปลี่ยนแปลงอย่างรอบคอบเพื่อป้องกันความล้มเหลว.
ปัจจัยทางกายภาพ
การสูญเสียสภาพเป็นสิ่งสำคัญ, และอุณหภูมิที่ไม่เพียงพอหรืออุณหภูมิการหลอมอาจทำให้เกิดลบที่ผิดพลาด. การใช้เทอร์โมมิเตอร์มาตรฐานเพื่อตรวจสอบอุณหภูมิเทอร์โมไซเลอร์หรืออุณหภูมิอ่างน้ำสามารถช่วยป้องกันความล้มเหลวได้.
การเปลี่ยนแปลงลำดับเป้าหมาย
การกลายพันธุ์หรือการลบในลำดับเป้าหมายอาจส่งผลกระทบต่อการผูกไพรเมอร์-เทมเพลต, นำไปสู่การขยายที่ล้มเหลว.
ข้อดีที่ผิดพลาด
แถบการขยาย PCR ที่สังเกตได้ตรงกับแถบลำดับเป้าหมาย, บางครั้งก็ปรากฏตัวขึ้นและสว่างขึ้นมากขึ้น. สาเหตุที่เป็นไปได้:
การออกแบบไพรเมอร์ที่ไม่เหมาะสม:
การเลือกลำดับการขยายด้วย homology เป็นลำดับที่ไม่ใช่เป้าหมายอาจส่งผลให้ผลิตภัณฑ์ขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงในระหว่าง PCR. ลำดับเป้าหมายสั้นหรือไพรเมอร์สามารถนำไปสู่ผลบวกที่ผิดพลาด. การออกแบบไพรเมอร์ใหม่เป็นสิ่งจำเป็น.
การปนเปื้อนข้ามของลำดับเป้าหมายหรือผลิตภัณฑ์ขยาย:
สาเหตุการปนเปื้อน:
- การปนเปื้อนของจีโนมทั้งหมดหรือส่วนใหญ่อาจนำไปสู่ผลบวกที่ผิดพลาด.
- การปนเปื้อนของชิ้นส่วนกรดนิวคลีอิกขนาดเล็กในอากาศยังสามารถทำให้เกิดผลบวกปลอม.
วิธีจัดการกับสถานการณ์นี้
1. การปฏิบัติในห้องปฏิบัติการที่เข้มงวด:
- จัดการตัวอย่างด้วยความระมัดระวังเพื่อป้องกันการสูดดมลำดับเป้าหมายลงในปิเปตหรือสาดท่อปั่นป่วนนอก.
- หม้อนึ่งความมั่งคั่งรีเอเจนต์และอุปกรณ์ทั้งหมด, ยกเว้นเอนไซม์และวัสดุที่ทนต่ออุณหภูมิสูง.
- ใช้หลอดเครื่องหมุนเหวี่ยงที่ใช้แล้วทิ้งและเคล็ดลับปิเปตเพื่อลดการปนเปื้อน.
2. การเปิดรับรังสี UV:
- เปิดเผยหลอดปฏิกิริยาและรีเอเจนต์ไปยังแสงอัลตราไวโอเลตก่อนที่จะเพิ่มตัวอย่างเพื่อทำลายกรดนิวคลีอิกที่มีอยู่.
- การพิจารณาการออกแบบไพรเมอร์:
- การออกแบบไพรเมอร์อย่างระมัดระวังเพื่อลดศักยภาพในการทำปฏิกิริยาข้ามด้วยลำดับที่ไม่ใช่เป้าหมาย.
- วิธี PCR ที่ซ้อนกัน:
- ใช้วิธีการ PCR ที่ซ้อนกันเพื่อลดหรือกำจัดผลบวกปลอมที่เกิดจากการปนเปื้อนของชิ้นส่วนกรดนิวคลีอิกขนาดเล็กในอากาศ.
ลักษณะของแถบขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจง
- หลังจากการขยาย PCR, วงดนตรีปรากฏว่ามีขนาดไม่สอดคล้องกับวงที่คาดหวัง, ใหญ่ขึ้นหรือเล็กลง, หรือทั้งแถบเฉพาะและไม่เฉพาะเจาะจงจะปรากฏขึ้นพร้อมกัน.
- สาเหตุของการปรากฏตัวของวงดนตรีที่ไม่เฉพาะเจาะจงคือ:
- ความสมบูรณ์ที่ไม่สมบูรณ์ระหว่างไพรเมอร์และลำดับเป้าหมาย, หรือการก่อตัวของไพรเมอร์หรี่.
- ความเข้มข้นของ Mg2+ ไอออนมากเกินไป, อุณหภูมิการหลอมต่ำเกินไป, และหมายเลขวัฏจักร PCR ที่มากเกินไป.
- คุณภาพและปริมาณของเอนไซม์, ด้วยเอนไซม์จากบางแหล่งที่มีแนวโน้มที่จะไม่เฉพาะเจาะจง, ในขณะที่คนอื่นไม่ได้.
- ปริมาณเอนไซม์ที่มากเกินไปบางครั้งอาจนำไปสู่การขยายแบบไม่เฉพาะเจาะจง.
- การตอบโต้รวมถึง:
- การออกแบบไพรเมอร์ใหม่หากจำเป็น.
- ลดปริมาณเอนไซม์หรือเปลี่ยนเป็นเอนไซม์จากแหล่งต่าง ๆ.
- การลดความเข้มข้นของไพรเมอร์, การเพิ่มความเข้มข้นของเทมเพลตอย่างเหมาะสม, และลดจำนวนรอบ.
- การเพิ่มอุณหภูมิการหลอมอย่างเหมาะสมหรือใช้วิธีจุดสองอุณหภูมิ (การสูญเสียสภาพที่ 93 ° C, การหลอมและการขยายเวลาประมาณ 65 ° C).
การปรากฏตัวของวง Smearing หรือ Streaking
การขยาย PCR บางครั้งส่งผลให้เกิดการเปื้อนหรือสาดแถบ.
- สิ่งนี้มักเกิดจากปริมาณเอนไซม์ที่มากเกินไปหรือคุณภาพของเอนไซม์ที่ไม่ดี, ความเข้มข้นของ DNTP สูง, ความเข้มข้น MG2+ มากเกินไป, อุณหภูมิการหลอมต่ำ, หรือหมายเลขวัฏจักรที่มากเกินไป.
- การตอบโต้รวมถึง:
- ลดปริมาณเอนไซม์หรือเปลี่ยนเป็นเอนไซม์จากแหล่งต่าง ๆ.
- ลดความเข้มข้นของ DNTP.
- ลดระดับความเข้มข้น Mg2+ อย่างเหมาะสม.
- การเพิ่มปริมาณเทมเพลต.
- ลดจำนวนวัฏจักร.
