Solarbio Phosphoenolpyruvate Carboxykinase (PEPCK) ชุดทดสอบกิจกรรม

คุณลักษณะ	รายละเอียด
บันทึก	ใช้ตัวอย่างที่แตกต่างกันสองหรือสามตัวอย่างเพื่อทำนายก่อนการทดสอบ
อุปกรณ์การดำเนินงาน	สเปกโตรโฟโตมิเตอร์
หมายเลขแมว	BC3310
ขนาด	50ที/48ส

ส่วนประกอบ:

สารสกัดโซลูชั่น: 60 ml × 1. การเก็บรักษาที่ 4 ℃.

รีเอเจนต์ I: 45 มล.×1, stored at 4℃.

รีเอเจนต์ II: ผง× 1, stored at -20℃ and protected from light. Dissolve it in 35 ML ของน้ำยาฉันก่อนใช้งาน. The reagent that cannot be used up shall be stored at -20℃ after repacking, repeat freezing and thawing are prohibited;

รีเอเจนต์ III: 45 ไมโครลิตร×1, stored at 4℃ and protected from light. Before temporary use, add distilled water to dilute according to the volume ratio of 1:120, to prepare when the solution will be used.

รีเอเจนต์ IV: 155 ไมโครลิตร×1, stored at 4℃ and protected from light. Before temporary use, add distilled water to dilute according to the volume ratio of 7:250, to prepare when the solution will be used.

รีเอเจนต์ V: ผง×1, stored at -20℃ and protected from light. Dissolve it in 2.5 ML ของน้ำกลั่นก่อนใช้งาน, the reagent that cannot be used up shall be stored at -20℃ after repacking, repeat freezing and thawing are prohibited;

รายละเอียดสินค้า:

PEPCK (อีซี 4.1.1.32) พบมากในสัตว์, flowering plants, algae, some fungi, and bacteria. The enzyme catalyzes the conversion of oxaloacetic acid to phosphoenolpyruvate, which is the first-rate limiting enzyme regulating gluconeogenesis.

PEPCK catalyzes oxaloacetic acid to form phosphoenolpyruvate and CO2, pyruvate kinase and lactate dehydrogenase further catalyze the oxidation of NADH to NAD+ in turn, and determine the NADH decline rate at 340 นาโนเมตร, which can reflect the PEPCK activity.

รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้

สเปกโตรโฟโตมิเตอร์, เครื่องหมุนเหวี่ยงอุณหภูมิต่ำ, water bath pot, 1 mL quartz cuvette, ปิเปตแบบปรับได้, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, น้ำแข็งและน้ำกลั่น

ขั้นตอน

ฉัน. การสกัดสารละลายเอนไซม์ดิบ:

1. 1. ตัวอย่างเนื้อเยื่อ:

สัดส่วนของมวลเนื้อเยื่อ (ก): volume of extract solution (มล): 1:5~10 (ขอแนะนำให้ชั่งน้ำหนักประมาณ 0.1 กรัมของเนื้อเยื่อ, เพิ่ม 1 mL of extract solution) for ice bath homogenate, then centrifugate at 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ℃, นำส่วนลอยเหนือตะกอนมาวางบนน้ำแข็งเพื่อทำการทดสอบ.

2. แบคทีเรียหรือเซลล์เพาะเลี้ยง:

อันดับแรก, collect bacteria or cells into the centrifuge tube, and then discard the supernatant. จำนวนเซลล์ (104): the volume of the extract (มล) เป็น 500-1000:1 (1 mL of the extract solution is recommended to be added to 5 million bacteria or cells), และเซลล์จะถูกทำลายด้วยคลื่นอัลตราโซนิกในอ่างน้ำแข็ง (พลัง: 200W or 20%, เกี่ยวกับอัลตราโซนิก:3ส, ช่วงเวลา:10ส, Repeat 30 ครั้ง). Then centrifuged at 8000 ×กรัม สำหรับ 10 นาทีที่ 4 ℃, นำส่วนลอยเหนือตะกอนมาวางบนน้ำแข็งเพื่อทำการทดสอบ.

3. ตัวอย่างเซรั่ม: ความมุ่งมั่นโดยตรง.

ครั้งที่สอง. ทดสอบ ขั้นตอน:

1. เปิดเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ให้ร้อนมากกว่า 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 340 นาโนเมตร, and adjust to zero with distilled
2. วิธีแก้ปัญหาการทำงาน: mix Reagent II, รีเอเจนต์ III, Reagent IV in the proportion of 7:1:1(วี:วี:วี) ก่อนใช้งาน. เตรียมเมื่อใช้วิธีแก้ปัญหา.
3. Preheat the working solution at 37℃ (สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม) หรือ 25 ℃ (สายพันธุ์อื่น) สำหรับ 5 นาที.
4. ตารางปฏิบัติการ: Add the following reagents to the 1 mL quartz cuvette in turn:

ชื่อรีเอเจนต์ (ไมโครลิตร)	หลอดเปล่า(บี)	หลอดทดลอง(ต)
ตัวอย่าง	–	50
น้ำกลั่น	50
วิธีแก้ปัญหาการทำงาน	900	900
รีเอเจนต์ V	50	50
Add Reagent V and mix it immediately. Measure the absorbance value A1 at 340 nm for 10s and A2 at 70s. Calculate ΔAT= A1T- A2T, ΔAB= A1B- A2B, and ΔA =ΔAT-ΔAB. Blank tube only needs to be done once or twice.

สาม. การคำนวณ PEPCK:

1. Calculation by micro quartz cuvette

• คำนวณโดยความเข้มข้นของโปรตีนเนื้อเยื่อ:

คำจำกัดความของกิจกรรมของเอนไซม์: one unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1 nmol of NADH per minute, โปรตีนทุกๆ มิลลิกรัม.

PEPCK activity (U/มก) = ΔA÷(ε× D)× VRT × 109 ÷ (VS × CPR) ÷ T =3215.4×ΔA÷Cpr

• คำนวณโดยคุณภาพของตัวอย่างเนื้อเยื่อ:

คำจำกัดความของกิจกรรมของเอนไซม์: one unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1 nmol of NADH per minute, ตัวอย่างทุกกรัม.

PEPCK activity (น้ำหนักสด U/G) = ΔA÷(ε× D)× VRT × 109 ÷ (vs ÷ vst × w) ÷T= 3215.4×ΔA÷W

• โดยจำนวนเซลล์:

คำจำกัดความของกิจกรรมของเอนไซม์: one unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1 nmol of NADH per minute every 10 thousand cells

PEPCK activity (เซลล์ U/104)= ΔA÷(ε× D)× VRV × 109 ÷(VS÷VST×500)÷T=6.43×ΔA

• คำนวณโดยปริมาณซีรั่ม:

คำจำกัดความของกิจกรรมของเอนไซม์: one unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1 nmol of NADH per minute every milliliter of serum

PEPCK activity (ยู/มล) = ΔA÷(ε× D)×VRV×109÷VS÷T=3215.4×ΔA

อี: Molar extinction coefficient of NADH, 6.22× 103 L/mol/cm; ง: เส้นผ่านศูนย์กลางแสงของ Cuvette, 1 ซม.;

VRT: ปริมาตรทั้งหมดของระบบปฏิกิริยา, 0.001 ล;

VS: ปริมาตรของตัวอย่างในระบบปฏิกิริยา, 0.05 มล; VST: ปริมาตรของสารละลายสารสกัด, 1 มล;

ซีพีอาร์: ตัวอย่างความเข้มข้นของโปรตีน, มก./มล, Self-determination of protein concentration; ว: มวลของมวลตัวอย่าง, ก;

ต: เวลาเกิดปฏิกิริยา, 1 นาที;

500: จำนวนแบคทีเรียหรือเซลล์ทั้งหมด, 5 ล้าน; 109: Unit conversion factor, 1 mol = 109 นาโนโมล.

บันทึก:

1. When A1 is less than 1 or ΔA is greater than 0.6, it is recommended to dilute the sample to a proper multiple before determination to improve the detection
2. For samples with high enzyme activity, such as animal liver, kidney and other tissues, it is recommended to dilute the extract to 5 times or more for
3. The blank tube is a test well for testing the quality of each reagent component. Under normal conditions, the change does not exceed06.
4. The steps of sample adding and mixing shall be rapid, and the stopwatch timing shall be accurate. If conditions permit, it is recommended that two persons cooperate to complete this

ตัวอย่างการทดลอง:

1. Take 0.1g liver and add 1 ml extract solution for homogenate. Take the supernatant and dilute it twice with the extract solution. Then operate according to the determination steps. Measure and calculate: ΔAT= A1D- A2D= 1.175-0.532=0.643, ΔAB= A1B – A2B =1.29-1.244=0.046, ΔA = ΔAT – ΔAB = 0.643-0.046 - 0.597

PEPCK activity (มวลยู/กรัม) = 3215.4×ΔA÷W×10 (อัตราส่วนการเจือจาง) = 3215.4×0.597÷0.1×10=191959.4 U/g mass.

2. Take 0.1g aloe vera and add 1 ml extract solution for homogenization, take the supernatant and operate according to the determination steps. Measure and calculate ΔAT = A1T- A2T =1.257-1.106=0.151, ΔAB= A1B- A2B =1.29-1.244=0.046, ΔA = ΔAT – ΔAB =0.151-0.046=0.105

PEPCK activity (มวลยู/กรัม) - 3215.4 × ΔA÷W =3215.4×0.105÷0.1=3376.17 U/g mass.

สินค้าที่เกี่ยวข้อง:

BC0730/BC0735 Pyruvate Carboxylase PC) ชุดทดสอบกิจกรรม

BC0920/BC0925 Fructose 1,6-bisphosphatase FBP) ชุดทดสอบกิจกรรม