พลังงานแสงอาทิตย์ไบโอกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (GSH-Px/GPX) ชุดทดสอบกิจกรรม

บันทึก: ใช้ตัวอย่างที่แตกต่างกันสองหรือสามตัวอย่างเพื่อทำนายก่อนการทดสอบ.

อุปกรณ์การดำเนินงาน: สเปกโตรโฟโตมิเตอร์

หมายเลขแมว: พ.ศ. 1190

ขนาด: 50ที/24ส

ส่วนประกอบ:

รายละเอียดสินค้า:

• กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (จีพีเอ็กซ์), หรือที่เรียกว่า GSH-Px หรือ GPX, เป็นเอนไซม์เปอร์ออกซิเดสที่สำคัญซึ่งพบได้ทั่วไปในร่างกาย.
• GPX มีบทบาทสำคัญในการเร่งการเปลี่ยนกลูตาไธโอนที่ลดลง (จีเอสเอช) เพื่อออกซิไดซ์กลูตาไธโอน (จีเอสเอสจี) และในการลดไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เป็นพิษให้เป็นสารประกอบไฮดรอกซิลที่ไม่เป็นพิษ.
• การกระทำของเอนไซม์ของ GPX เกี่ยวข้องกับการออกซิเดชันของ GSH โดยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์, ส่งผลให้มีการผลิต GSSG.
• GSH ทำปฏิกิริยากับ DTNB เพื่อสร้างสารประกอบที่มีคุณลักษณะการดูดซับสูงสุดที่ 412 นาโนเมตร.
• การดูดกลืนแสงลดลงที่ 412 nm ทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้กิจกรรม GPX.

รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้:

สเปกโตรโฟโตมิเตอร์, สมดุล, เครื่องหมุนเหวี่ยงแบบตั้งโต๊ะ, 1 คิวเวตต์แก้วขนาดมล, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, ท่ออีพี.

ขั้นตอน

ฉัน. การจัดเตรียมตัวอย่าง:

เนื้อเยื่อ:

ตามอัตราส่วน น้ำหนักเนื้อเยื่อ (ก): สารสกัดโซลูชั่น (มล)=1:5~10 (แนะนำเนื้อเยื่อ 0.05 กรัมพร้อมสารละลายสารสกัด 1 มล), ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันบนอ่างน้ำแข็ง. เครื่องปั่นแยกที่ 5000 รอบต่อนาทีที่ 4 ℃ สำหรับ 10 นาที, เอาส่วนเหนือตะกอนไป, และนำไปวางบนน้ำแข็งเพื่อทดสอบ (หากส่วนเหนือตะกอนไม่ชัดเจน, เครื่องหมุนเหวี่ยงสำหรับ 3 นาที).

แบคทีเรียหรือเซลล์

จำนวนเซลล์ (104): สารสกัดโซลูชั่น (มล): 500~1,000:1 (เติมสารละลายสารสกัด 1 มล. ลงไป 5 ล้านเซลล์), อัลตราโซนิกพร้อมอ่างน้ำแข็งเพื่อทำลายเซลล์(300ว,3ส, ช่วงเวลา 7 วินาที,เวลาทั้งหมด 3 นาที). ปั่นเหวี่ยงที่ 5000 รอบต่อนาทีที่ 4 ℃ สำหรับ 10 นาที, นำส่วนที่ลอยเหนือตะกอนมาวางบนน้ำแข็งเพื่อทำการทดสอบ (หากส่วนเหนือตะกอนไม่ชัดเจน, เครื่องหมุนเหวี่ยงสำหรับ 3 นาที).

ตัวอย่างเซรั่ม: ตรวจจับได้โดยตรง

ครั้งที่สอง. การกำหนด ขั้นตอน:

1. เปิดเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ก่อน 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 412 นาโนเมตร, และตั้งค่าศูนย์ด้วยน้ำกลั่น.
2. โซลูชั่นมาตรฐานของ 20 ไมโครโมล/มิลลิลิตร ถูกเจือจางจนถึง 0.25 ไมโครโมล/มล. ด้วยสารละลายสำหรับการสกัด. โซลูชั่นมาตรฐานของ 100 μL ผสมกับ 400 μL ของรีเอเจนต์ IV, และความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐานคือ 0.05 ไมโครโมล/มล. สารละลายมาตรฐานจะถูกเตรียมเมื่อใช้ส่วนผสมของสารละลาย.
3. ผสม 150 μL ของตัวอย่างด้วย 150 μLof reagent I และวางไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที.
4. ตารางปฏิบัติการ: (1.5 หลอดหมุนเหวี่ยงขนาด mL พร้อมด้วยรีเอเจนต์ต่อไปนี้ตามลำดับ).

เครื่องปั่นแยกที่ 4000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาทีแล้วนำส่วนเหนือตะกอนไปไว้ในหลอด EP.

ผสมให้เข้ากัน. แล้วนำไปวางที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที, การดูดกลืนแสงที่ 412 วัดเป็นนาโนเมตร. การดูดกลืนแสงจะถูกบันทึกเป็น AT, เครื่องปรับอากาศ, เช่น, และเอบี, ตามลำดับ. คำนวณ ∆AT = AC – ที่, ∆AS= AS – เอบี.

สาม. การคำนวณ:

การคำนวณเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง =(เอซี-เอที)/(เอซี-เอบี)×100%

เท่าที่จะเป็นไปได้, เปอร์เซ็นต์การยับยั้งของตัวอย่างอยู่ในช่วง 30-70%, และยิ่งใกล้เข้าไปอีก 50%, ยิ่งแม่นยำมากขึ้นเท่านั้น. หากเปอร์เซ็นต์การยับยั้งน้อยกว่า 30% หรือมากกว่านั้น 70%, โดยปกติจำเป็นต้องปรับขนาดยาและพิจารณาใหม่. หากเปอร์เซ็นต์การยับยั้งสูง, ควรเจือจางตัวอย่างอย่างเหมาะสม. หากเปอร์เซ็นต์การยับยั้งต่ำ, ควรเตรียมตัวอย่างที่มีความเข้มข้นสูงอีกครั้ง.

การคำนวณกิจกรรม GPX

• ความเข้มข้นของโปรตีน:

คำจำกัดความของหน่วย: กิจกรรมของเอนไซม์หนึ่งหน่วยถูกกำหนดให้เป็นปริมาณของเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของ 1nmol ของ GSH ต่อนาทีในระบบปฏิกิริยา, โปรตีนทุกๆ มิลลิกรัม.

จีพีเอ็กซ์ (U/มก) =∆AT۞(∆AS∆CS)×1000×VEV÷(ซีพีอาร์×VSV)۞T=200×ΔAT۞AS۞Cpr

• น้ำหนักตัวอย่าง

คำจำกัดความของหน่วย: กิจกรรมของเอนไซม์หนึ่งหน่วยหมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่กระตุ้นการเกิดออกซิเดชันของ 1 nmol ของ GSH ต่อนาทีในระบบปฏิกิริยา, ตัวอย่างทุกกรัม.

จีพีเอ็กซ์ (น้ำหนักยู/กรัม) =∆AT۞(∆AS∆CS)×1000×VEV÷(VSV۞VTV×W)۞T=200×ΔAT۞AS۞W

• จำนวนเซลล์

คำจำกัดความของหน่วย: กิจกรรมของเอนไซม์หนึ่งหน่วยถูกกำหนดให้เป็นปริมาณของเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของ 1nmol ของ GSH ต่อนาทีในระบบปฏิกิริยา, ทั้งหมด 104 เซลล์.

จีพีเอ็กซ์(U/104เซลล์) =∆AT۞(∆AS∆CS)×1000×VEV÷(N×VSVศตวรรษVTV)۞T=200×ΔAT۞AS۞N

• ปริมาณของเหลว:

คำจำกัดความของหน่วย: กิจกรรมของเอนไซม์หนึ่งหน่วยหมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่กระตุ้นการเกิดออกซิเดชันของ 1 nmol ของ GSH ต่อนาทีในระบบปฏิกิริยา, ของเหลวทุกๆ มิลลิลิตร.

จีพีเอ็กซ์ (ยู/มล)=∆AT۞(∆AS∆CS)×1000×VEV۞VS۞T=200×ΔAT۞AS.

ซีเอส: ความเข้มข้นของสารผสมมาตรฐาน, 0.08 ไมโครโมล/มล;

วีอีวี: ปริมาตรของระบบปฏิกิริยาของเอนไซม์, 1.25มล;

เทียบกับ: ปริมาตรตัวอย่างที่มีอยู่ในสารผสมตัวอย่าง, 0.1 มล; วีทีวี: ปริมาณสารละลายในการสกัด, 1 มล;

ซีพีอาร์: ความเข้มข้นของโปรตีนเหนือตะกอน, มก./มล;

ต: เวลาเกิดปฏิกิริยา, 5 นาที;

เอ็น: จำนวนเซลล์, นับหมื่น; ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก;

1000: 1 ไมโครโมล=1,000 นาโนโมล.

บันทึก:

1. เมื่อค่าการดูดกลืนแสงมากกว่า 1.2, แนะนำให้หาตัวอย่างหลังจากเจือจางด้วยการสกัดแล้ว
2. ขอแนะนำไม่ให้เก็บตัวอย่างมากเกินไปในแต่ละครั้ง, เพื่อหลีกเลี่ยงอิทธิพลของเวลาทดสอบที่นานเกินไปต่อการพัฒนาสี, ซึ่งอาจทำให้ตัดสินใจไม่ได้

กรณีทดลอง：

• รับประทานตับหนู 0.1 กรัม, เติมสารละลายสารสกัด 1 มล, ทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน, และบด. เอาส่วนเหนือตะกอนไป, เจือจางด้วย 40 ครั้ง, และทดสอบตามการวัด คำนวณ AT=0.108, เอซี=0.303, AS=0.491AB=0.033,∆AT=AC-AT=0.195 ∆AS= AS-AB=0.458, คำนวณกิจกรรมของเอนไซม์ตามน้ำหนักตัวอย่าง:

จีพีเอ็กซ์ (น้ำหนักยู/กรัม)=200×ΔAT۞AS۞W×40（อัตราส่วนเจือจาง）=34061 U/g.

• ใช้ใบป็อปลาร์ 1 กรัม, เติมสารละลายสารสกัด 1 มล, ทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน, และบด. คำนวณ AT=0.220, เอซี=0.318, AS=0.491, เอบี=0.033, ∆AT=AC-AT=0.098,∆AS=AB-AB=0.458, คำนวณกิจกรรมของเอนไซม์ตามน้ำหนักตัวอย่าง:

จีพีเอ็กซ์ (น้ำหนักยู/กรัม)=200×ΔAT۞AS۞W=428 U/g.