บันทึก: ใช้ตัวอย่างที่แตกต่างกันสองหรือสามตัวอย่างเพื่อทำนายก่อนการทดสอบ.
อุปกรณ์การดำเนินงาน: สเปกโตรโฟโตมิเตอร์
หมายเลขแมว: พ.ศ. 1190
ขนาด: 50ที/24ส
ส่วนประกอบ:
| รีเอเจนต์ | จำนวน | พื้นที่จัดเก็บ | การตระเตรียม |
|---|---|---|---|
| สารสกัดโซลูชั่น | 30 มล. × 1 | 4องศาเซลเซียส | – |
| รีเอเจนต์ I | ผง × 2 | 4องศาเซลเซียส | เพิ่ม 3.3 มล. ของเจือจางที่จะละลายเมื่อใช้. |
| รีเอเจนต์ II | 10 ไมโครลิตร × 1 | 4องศาเซลเซียส | เจือจางด้วย 2 μL รีเอเจนต์ II และ 10 มล. น้ำกลั่นก่อนการใช้งาน. |
| รีเอเจนต์ III | 60 มล. × 1 | 4องศาเซลเซียส | ละลายก้นที่ตกผลึกในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 50°C. ใช้ส่วนลอยเหนือตะกอนหากก้นขวดยังคงตกผลึกอยู่. |
| รีเอเจนต์ IV | 30 มล. × 1 | 4องศาเซลเซียส | – |
| รีเอเจนต์ V | 10 มล. × 1 | 4องศาเซลเซียส | – |
| มาตรฐาน | ผง × 1 | 4องศาเซลเซียส | เพิ่ม 0.405 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นถึง 10 มก. ของกลูตาไธโอนลดลง (จีเอสเอช) เมื่อใช้. |
| เจือจาง | 20 มล. × 1 | 4องศาเซลเซียส | – |
รายละเอียดสินค้า:
- กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (จีพีเอ็กซ์), หรือที่เรียกว่า GSH-Px หรือ GPX, เป็นเอนไซม์เปอร์ออกซิเดสที่สำคัญซึ่งพบได้ทั่วไปในร่างกาย.
- GPX มีบทบาทสำคัญในการเร่งการเปลี่ยนกลูตาไธโอนที่ลดลง (จีเอสเอช) เพื่อออกซิไดซ์กลูตาไธโอน (จีเอสเอสจี) และในการลดไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เป็นพิษให้เป็นสารประกอบไฮดรอกซิลที่ไม่เป็นพิษ.
- การกระทำของเอนไซม์ของ GPX เกี่ยวข้องกับการออกซิเดชันของ GSH โดยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์, ส่งผลให้มีการผลิต GSSG.
- GSH ทำปฏิกิริยากับ DTNB เพื่อสร้างสารประกอบที่มีคุณลักษณะการดูดซับสูงสุดที่ 412 นาโนเมตร.
- การดูดกลืนแสงลดลงที่ 412 nm ทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้กิจกรรม GPX.
รีเอเจนต์และอุปกรณ์ที่จำเป็นแต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้ให้:
สเปกโตรโฟโตมิเตอร์, สมดุล, เครื่องหมุนเหวี่ยงแบบตั้งโต๊ะ, 1 คิวเวตต์แก้วขนาดมล, ปูน/โฮโมจีไนเซอร์, ท่ออีพี.
ขั้นตอน
ฉัน. การจัดเตรียมตัวอย่าง:
เนื้อเยื่อ:
ตามอัตราส่วน น้ำหนักเนื้อเยื่อ (ก): สารสกัดโซลูชั่น (มล)=1:5~10 (แนะนำเนื้อเยื่อ 0.05 กรัมพร้อมสารละลายสารสกัด 1 มล), ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันบนอ่างน้ำแข็ง. เครื่องปั่นแยกที่ 5000 รอบต่อนาทีที่ 4 ℃ สำหรับ 10 นาที, เอาส่วนเหนือตะกอนไป, และนำไปวางบนน้ำแข็งเพื่อทดสอบ (หากส่วนเหนือตะกอนไม่ชัดเจน, เครื่องหมุนเหวี่ยงสำหรับ 3 นาที).
แบคทีเรียหรือเซลล์
จำนวนเซลล์ (104): สารสกัดโซลูชั่น (มล): 500~1,000:1 (เติมสารละลายสารสกัด 1 มล. ลงไป 5 ล้านเซลล์), อัลตราโซนิกพร้อมอ่างน้ำแข็งเพื่อทำลายเซลล์(300ว,3ส, ช่วงเวลา 7 วินาที,เวลาทั้งหมด 3 นาที). ปั่นเหวี่ยงที่ 5000 รอบต่อนาทีที่ 4 ℃ สำหรับ 10 นาที, นำส่วนที่ลอยเหนือตะกอนมาวางบนน้ำแข็งเพื่อทำการทดสอบ (หากส่วนเหนือตะกอนไม่ชัดเจน, เครื่องหมุนเหวี่ยงสำหรับ 3 นาที).
ตัวอย่างเซรั่ม: ตรวจจับได้โดยตรง
ครั้งที่สอง. การกำหนด ขั้นตอน:
- เปิดเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ก่อน 30 นาที, ปรับความยาวคลื่นเป็น 412 นาโนเมตร, และตั้งค่าศูนย์ด้วยน้ำกลั่น.
- โซลูชั่นมาตรฐานของ 20 ไมโครโมล/มิลลิลิตร ถูกเจือจางจนถึง 0.25 ไมโครโมล/มล. ด้วยสารละลายสำหรับการสกัด. โซลูชั่นมาตรฐานของ 100 μL ผสมกับ 400 μL ของรีเอเจนต์ IV, และความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐานคือ 0.05 ไมโครโมล/มล. สารละลายมาตรฐานจะถูกเตรียมเมื่อใช้ส่วนผสมของสารละลาย.
- ผสม 150 μL ของตัวอย่างด้วย 150 μLof reagent I และวางไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที.
- ตารางปฏิบัติการ: (1.5 หลอดหมุนเหวี่ยงขนาด mL พร้อมด้วยรีเอเจนต์ต่อไปนี้ตามลำดับ).
| ชื่อรีเอเจนต์(ไมโครลิตร) | หลอดทดลอง (ต) | หลอดควบคุม (ค) |
| ตัวอย่างส่วนเหนือตะกอน | 100 | – |
| รีเอเจนต์ I | 100 | 100 |
| เปิดเครื่องเพื่อ 5 นาทีที่ 37 ℃ | ||
| รีเอเจนต์ II | 50 | 50 |
| ปฏิกิริยาสำหรับ 5 นาทีที่ 37 ℃ | ||
| รีเอเจนต์ III | 1000 | 1000 |
| ตัวอย่างสารผสม | – | 100 |
เครื่องปั่นแยกที่ 4000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาทีแล้วนำส่วนเหนือตะกอนไปไว้ในหลอด EP.
| ชื่อรีเอเจนต์(ไมโครลิตร) | หลอดทดลอง (ต) | หลอดควบคุม (ค) | หลอดมาตรฐาน (ส) | หลอดสีดำ (บี) |
| เจือจาง | – | – | – | 500 |
| เหนือตะกอน | 500 | 500 | – | – |
| สารผสมมาตรฐาน | – | – | 500 | – |
| รีเอเจนต์ IV | 500 | 500 | 500 | 500 |
| รีเอเจนต์ V | 125 | 125 | 125 | 125 |
ผสมให้เข้ากัน. แล้วนำไปวางที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที, การดูดกลืนแสงที่ 412 วัดเป็นนาโนเมตร. การดูดกลืนแสงจะถูกบันทึกเป็น AT, เครื่องปรับอากาศ, เช่น, และเอบี, ตามลำดับ. คำนวณ ∆AT = AC – ที่, ∆AS= AS – เอบี.
สาม. การคำนวณ:
การคำนวณเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง เปอร์เซ็นต์การยับยั้ง =(เอซี-เอที)/(เอซี-เอบี)×100%
เท่าที่จะเป็นไปได้, เปอร์เซ็นต์การยับยั้งของตัวอย่างอยู่ในช่วง 30-70%, และยิ่งใกล้เข้าไปอีก 50%, ยิ่งแม่นยำมากขึ้นเท่านั้น. หากเปอร์เซ็นต์การยับยั้งน้อยกว่า 30% หรือมากกว่านั้น 70%, โดยปกติจำเป็นต้องปรับขนาดยาและพิจารณาใหม่. หากเปอร์เซ็นต์การยับยั้งสูง, ควรเจือจางตัวอย่างอย่างเหมาะสม. หากเปอร์เซ็นต์การยับยั้งต่ำ, ควรเตรียมตัวอย่างที่มีความเข้มข้นสูงอีกครั้ง.
การคำนวณกิจกรรม GPX
- ความเข้มข้นของโปรตีน:
คำจำกัดความของหน่วย: กิจกรรมของเอนไซม์หนึ่งหน่วยถูกกำหนดให้เป็นปริมาณของเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของ 1nmol ของ GSH ต่อนาทีในระบบปฏิกิริยา, โปรตีนทุกๆ มิลลิกรัม.
จีพีเอ็กซ์ (U/มก) =∆AT۞(∆AS∆CS)×1000×VEV÷(ซีพีอาร์×VSV)۞T=200×ΔAT۞AS۞Cpr
- น้ำหนักตัวอย่าง
คำจำกัดความของหน่วย: กิจกรรมของเอนไซม์หนึ่งหน่วยหมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่กระตุ้นการเกิดออกซิเดชันของ 1 nmol ของ GSH ต่อนาทีในระบบปฏิกิริยา, ตัวอย่างทุกกรัม.
จีพีเอ็กซ์ (น้ำหนักยู/กรัม) =∆AT۞(∆AS∆CS)×1000×VEV÷(VSV۞VTV×W)۞T=200×ΔAT۞AS۞W
- จำนวนเซลล์
คำจำกัดความของหน่วย: กิจกรรมของเอนไซม์หนึ่งหน่วยถูกกำหนดให้เป็นปริมาณของเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของ 1nmol ของ GSH ต่อนาทีในระบบปฏิกิริยา, ทั้งหมด 104 เซลล์.
จีพีเอ็กซ์(U/104เซลล์) =∆AT۞(∆AS∆CS)×1000×VEV÷(N×VSVศตวรรษVTV)۞T=200×ΔAT۞AS۞N
- ปริมาณของเหลว:
คำจำกัดความของหน่วย: กิจกรรมของเอนไซม์หนึ่งหน่วยหมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่กระตุ้นการเกิดออกซิเดชันของ 1 nmol ของ GSH ต่อนาทีในระบบปฏิกิริยา, ของเหลวทุกๆ มิลลิลิตร.
จีพีเอ็กซ์ (ยู/มล)=∆AT۞(∆AS∆CS)×1000×VEV۞VS۞T=200×ΔAT۞AS.
ซีเอส: ความเข้มข้นของสารผสมมาตรฐาน, 0.08 ไมโครโมล/มล;
วีอีวี: ปริมาตรของระบบปฏิกิริยาของเอนไซม์, 1.25มล;
เทียบกับ: ปริมาตรตัวอย่างที่มีอยู่ในสารผสมตัวอย่าง, 0.1 มล; วีทีวี: ปริมาณสารละลายในการสกัด, 1 มล;
ซีพีอาร์: ความเข้มข้นของโปรตีนเหนือตะกอน, มก./มล;
ต: เวลาเกิดปฏิกิริยา, 5 นาที;
เอ็น: จำนวนเซลล์, นับหมื่น; ว: น้ำหนักตัวอย่าง, ก;
1000: 1 ไมโครโมล=1,000 นาโนโมล.
บันทึก:
- เมื่อค่าการดูดกลืนแสงมากกว่า 1.2, แนะนำให้หาตัวอย่างหลังจากเจือจางด้วยการสกัดแล้ว
- ขอแนะนำไม่ให้เก็บตัวอย่างมากเกินไปในแต่ละครั้ง, เพื่อหลีกเลี่ยงอิทธิพลของเวลาทดสอบที่นานเกินไปต่อการพัฒนาสี, ซึ่งอาจทำให้ตัดสินใจไม่ได้
กรณีทดลอง：
- รับประทานตับหนู 0.1 กรัม, เติมสารละลายสารสกัด 1 มล, ทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน, และบด. เอาส่วนเหนือตะกอนไป, เจือจางด้วย 40 ครั้ง, และทดสอบตามการวัด คำนวณ AT=0.108, เอซี=0.303, AS=0.491AB=0.033,∆AT=AC-AT=0.195 ∆AS= AS-AB=0.458, คำนวณกิจกรรมของเอนไซม์ตามน้ำหนักตัวอย่าง:
จีพีเอ็กซ์ (น้ำหนักยู/กรัม)=200×ΔAT۞AS۞W×40（อัตราส่วนเจือจาง）=34061 U/g.
- ใช้ใบป็อปลาร์ 1 กรัม, เติมสารละลายสารสกัด 1 มล, ทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน, และบด. คำนวณ AT=0.220, เอซี=0.318, AS=0.491, เอบี=0.033, ∆AT=AC-AT=0.098,∆AS=AB-AB=0.458, คำนวณกิจกรรมของเอนไซม์ตามน้ำหนักตัวอย่าง:
จีพีเอ็กซ์ (น้ำหนักยู/กรัม)=200×ΔAT۞AS۞W=428 U/g.
รีวิว
ยังไม่มีบทวิจารณ์