Solarbio Annexin V PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

ภาพรวมผลิตภัณฑ์

การแนะนำสินค้า:

• การเปลี่ยนแปลงของการตายของเซลล์ในระยะเริ่มแรกเกิดขึ้นที่ผิวเยื่อหุ้มเซลล์.
• หนึ่งในการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้คือการถ่ายโอนฟอสฟาติดิลซีรีน (ป.ล) จากภายในสู่ภายนอกเยื่อหุ้มเซลล์, เผยให้เห็น PS บนพื้นผิวด้านนอก.
• PS คือฟอสโฟลิพิดที่มีประจุลบซึ่งส่วนใหญ่พบที่พื้นผิวด้านในของเยื่อหุ้มเซลล์.
• ในระหว่างการตายของเซลล์, ความไม่สมดุลของการกระจายตัวของฟอสโฟไลปิดถูกรบกวน, การเปิดเผย PS จากภายนอก.
• Annexin V เชื่อมโยงกับ PS ได้ง่ายและมีความสัมพันธ์กับมันสูง, ทำให้เป็นหัววัดที่ละเอียดอ่อนในการตรวจจับ PS บนพื้นผิวเยื่อหุ้มเซลล์.
• การถ่ายโอน PS ไปยังเยื่อหุ้มชั้นนอกไม่ได้เกิดขึ้นเฉพาะกับการตายของเซลล์เท่านั้น แต่ยังสามารถเกิดขึ้นได้ในเนื้อร้ายของเซลล์อีกด้วย.
• ความแตกต่างที่สำคัญคือเยื่อหุ้มเซลล์ยังคงสภาพสมบูรณ์ในระยะแรกของการตายของเซลล์, ในขณะที่มันถูกทำลายในเนื้อร้ายของเซลล์ในระยะเริ่มแรก.
• ดังนั้น, สามารถใช้วิธีการย้อมสีสองครั้งของ Annexin V และ 7-AAD เพื่อตรวจหาการตายของเซลล์ในระยะเริ่มแรกผ่านโฟลไซโตเมทรี.

การวิเคราะห์โฟลไซโตเมตริกของเซลล์ Jurkat โดยใช้ Annexin V-PE/7AAD หลังจากกระตุ้นการตายของเซลล์ด้วยซิสพลาติน

วิธีการดำเนินงาน: (สำหรับการอ้างอิงเท่านั้น)

1. การเตรียมตัวอย่างเซลล์：
2. สำหรับเซลล์ที่เกาะติด: รวบรวมอาหารเลี้ยงเซลล์อย่างระมัดระวังลงในหลอดหมุนเหวี่ยงเพื่อย่อยเซลล์ด้วยทริปซินโดยไม่มี EDTA ในภายหลัง. เมื่อเซลล์สามารถปิเปตลงเบาๆ ด้วยปิเปตหรือปลายปิเปต, เพิ่มสารละลายเพาะเลี้ยงเซลล์ที่รวบรวมไว้ก่อนหน้านี้, ปิเปตลงไปตามเซลล์ที่เกาะติดทั้งหมด, และเป่าเซลล์ออกอย่างอ่อนโยน. รวบรวมอีกครั้งลงในหลอดหมุนเหวี่ยง. ปั่นแยกที่ประมาณ 1000 รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาทีในการอัดเป็นก้อนเซลล์. สำหรับเซลล์เฉพาะ, หากเซลล์ไม่สามารถปั่นเหวี่ยงจนสุดจนถึงก้นหลอดปั่นเหวี่ยงได้, คุณสามารถขยายเวลาการปั่นแยกได้อย่างเหมาะสมหรือเพิ่มแรงเหวี่ยงเล็กน้อย. ดูดส่วนที่ลอยออกไปอย่างระมัดระวัง. สามารถคงของเหลวเพาะเลี้ยงไว้ได้ประมาณ 50μl เพื่อหลีกเลี่ยงการดูดเซลล์. เติม PBS แช่เย็นล่วงหน้าอุณหภูมิ 4°C ประมาณ 1 มล, แขวนลอยเซลล์อีกครั้ง, ปั่นแยกอีกครั้งเพื่ออัดเม็ดเซลล์, และดูดส่วนที่อยู่เหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง;
3. สำหรับเซลล์แขวนลอย: ปั่นแยกที่ประมาณ 1000 รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาทีในการอัดเป็นก้อนเซลล์. สำหรับเซลล์เฉพาะ, หากเซลล์ไม่สามารถปั่นเหวี่ยงจนสุดจนถึงก้นหลอดปั่นเหวี่ยงได้, คุณสามารถขยายเวลาการปั่นแยกได้อย่างเหมาะสมหรือเพิ่มแรงเหวี่ยงเล็กน้อย. ดูดของเหลวเพาะเลี้ยงประมาณ 50μl ที่เหลืออย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้เซลล์ดูดเข้าไป. เติม PBS แช่เย็นล่วงหน้าอุณหภูมิ 4°C ประมาณ 1 มล, แขวนลอยเซลล์อีกครั้ง, ปั่นแยกอีกครั้งเพื่ออัดเม็ดเซลล์, และดูดส่วนที่อยู่เหนือตะกอนอย่างระมัดระวัง;
4. เจือจางบัฟเฟอร์การยึดเกาะ 1:3ด้วยน้ำปราศจากไอออน (4บัฟเฟอร์การผูก ml 4x + 12มล. น้ำปราศจากไอออน);
5. แขวนเซลล์ใหม่ด้วยบัฟเฟอร์สำหรับจับ 1x และปรับความเข้มข้นเป็น 1-5×106/มล;
6. Take 100µl of cell suspension into a 5ml flow tube, add 5µl Annexin V/PE to mix well, and incubate for 5 minutes at room temperature in the dark;
7. Add 10µl of 20ug/ml 7AAD and 400µl of PBS to perform flow detection

Experimental design:

1. Untransfected cells

• หลอดเปล่า: Negative control cells, without Annexin V/PE, 7AAD, used to adjust voltage.
• Single staining tube: positive control cells, only with Annexin V/PE or only 7AAD for adjustment and compensation.
• Detection tube: treated cells, add Annexin V/PE, 7AAD. After adjusting the voltage compensation with the blank tube and the single dye tube, the required flow data can be obtained.

2. Transfection with GFP

• Untransfected blank tube: untransfected cells, without Annexin V/PE, 7AAD, were used to adjust the voltage.
• Untransfected single-stained tube: For untransfected cells with obvious apoptosis, เพิ่มเฉพาะ Annexin V/PE หรือ 7AAD เท่านั้นสำหรับการปรับและการชดเชย.
• การเปลี่ยนหลอดเปล่า GFP: แปลงเซลล์ควบคุม GFP โดยไม่มี Annexin V/PE, 7AAD สำหรับการปรับและการชดเชย.
• Detection tube: treated cells, บวกกับภาคผนวก V/PE, 7AAD. หลังจากปรับการชดเชยแรงดันไฟฟ้าแล้ว, รับข้อมูลสตรีมมิ่งที่จำเป็น.

ข้อควรระวัง:

1. AnnexinV เข้ากันได้กับฟอสฟาติดิลซีรีน (ป.ล), และ PS ไม่มีความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ต่างๆ. ในเซลล์ปกติ, PS มีการกระจายที่ด้านในของไขมัน bilayer ของเยื่อหุ้มเซลล์เท่านั้น. ในระยะแรกของการตายของเซลล์, PS เปลี่ยนจากด้านในของเมมเบรนไขมันไปด้านนอก.
2. ย่อยด้วยทริปซินที่มีความเข้มข้นต่ำ, เป่าเซลล์ที่เกาะติดอย่างอ่อนโยน 2 ถึง 3 ครั้ง, และปั่นเหวี่ยงที่อุณหภูมิ 4°C 1000 รอบต่อนาทีสำหรับ 5 นาที, หากได้รับการจัดการอย่างเหมาะสม, ความเสียหายที่เกิดจากทริปซินสามารถควบคุมได้ภายใน 5%. หากมีกลุ่มควบคุม, ผลการทดลองจะไม่ทำให้เกิดนัยสำคัญ
3. เพิ่ม PI ก่อน. ไม่เพียงแต่เป็นการยากที่จะตัดสินว่าการย้อมสีมีความสม่ำเสมอและเพียงพอสำหรับแต่ละกลุ่มหรือไม่, แต่ PI เองก็เป็นพิษต่อเซลล์เช่นกัน และจะมีผลกระทบต่อผลการทดลองมากกว่าตับอ่อน. ไม่แนะนำสิ่งนี้.
4. AnnexinV เป็นโปรตีนที่ขึ้นกับ Ca, ดังนั้นจึงไม่สามารถเติม EDTA เพื่อป้องกันไม่ให้ EDTA จากการคีเลต Ca ไอออน และส่งผลต่อ Annexin V, จึงส่งผลกระทบต่อ
5. เมื่อใช้โฟลไซโตเมทรีเพื่อตรวจหาการตายของเซลล์, 7AAD ได้รับผลกระทบอย่างมากจากเวลา. เนื่องจาก 7AAD มีป้ายกำกับ, มันจะเพิ่มความเป็นพิษต่อเซลล์. เมื่อเวลาผ่านไป, มันจะเพิ่มการย้อมสีของ 7AAD, โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อตรวจพบการตายของเซลล์ตั้งแต่เนิ่นๆ. นอกเหนือจากการเพิ่มช่องว่างระหว่างประชากรเซลล์บนโฟลว์ไซโตมิเตอร์แล้ว, ข้อผิดพลาดจะเพิ่มขึ้นอย่างมาก. โดยทั่วไป, 7AAD is added and the machine is immediately on the machine, and then the test is completed within a Both methods are ok, but the error caused by following our operating steps will be smaller.

Related literature:

[1] Ruifeng Zhao, Jing Jin, Xinyu Sun, และคณะ. The establishment of a clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell. Journal of Cellular Biochemistry. August 2018. (IF 2.959)