ขั้นตอน qPCR สำหรับการตรวจจับ Chlamydia เกี่ยวข้องกับสองขั้นตอนหลัก: การสกัดดีเอ็นเอและการขยายและการตรวจสอบ DNA ที่ตามมา. เริ่มแรก, เราจะมุ่งเน้นไปที่การแบ่งปันเนื้อหาการเรียนรู้ที่เกี่ยวข้องกับการสกัดดีเอ็นเอ. บทความนี้นำไปสู่รากฐานทางทฤษฎีและการแนะนำสารรีเอเจนต์ที่ใช้.
หลักการทำให้บริสุทธิ์ทางทฤษฎีของการสกัดดีเอ็นเอก่อนทำการทดลอง, การทำความเข้าใจหลักการพื้นฐานและขั้นตอนการดำเนินงานเป็นประโยชน์. ช่วยให้เราเข้าใจการทดลอง, มองเห็นผลลัพธ์ที่เป็นไปได้, และหลีกเลี่ยงเพียงแค่เป็นผู้ให้บริการซ้ำ ๆ.
หลักการพื้นฐานของการสกัดดีเอ็นเอ
ความสมบูรณ์ของโครงสร้างดีเอ็นเอ: เช่น, หลักการที่อยู่เบื้องหลังการตรวจจับ Chlamydia ที่ใช้การตรวจสอบ qPCR เกี่ยวข้องกับการตรวจจับเฉพาะของหนองในเทียมโดยการขยายภูมิภาคการเข้ารหัส 16SRRNA ในจีโนม Chlamydia. การขยายเฉพาะของ Chlamydia สามารถตรวจพบได้ที่ 520nm (ช่อง FAM). DNA Chlamydia ที่ไม่สมบูรณ์จะล้มเหลวในการผ่านการขยายและตรวจจับลักษณะเฉพาะ.
การพิจารณา:
(1) เพื่อให้แน่ใจว่าสิ่งนี้, ขั้นตอนการทดลองของเราควรเกี่ยวข้องกับการจัดการอย่างอ่อนโยนเพื่อป้องกันการย่อยสลายของดีเอ็นเอ.
(2) ควรให้ความสนใจกับการยับยั้ง DNases.
(3) หากเราซื้อชุดรีเอเจนต์ QPCR Chlamydia เท่านั้นโดยไม่ต้องใช้ชุดรีเอเจนต์การสกัดที่สอดคล้องกัน, เราไม่เพียง แต่ต้องทดสอบการบังคับใช้ของชุดทดสอบ แต่ยังตรวจสอบประสิทธิภาพของกระบวนการสกัดของเรา.
1.1.2 ความบริสุทธิ์ของ DNA: พยายามกำจัดสารโมเลกุลขนาดใหญ่อื่น ๆ ที่อาจรบกวน DNA, ดังนั้นการหลีกเลี่ยงผลกระทบใด ๆ ต่อการทดลองที่ตามมา. ตรวจสอบให้แน่ใจว่าตัวอย่างที่สกัดไม่มีตัวทำละลายอินทรีย์หรือไอออนโลหะที่มีความเข้มข้นสูงที่ยับยั้งเอนไซม์.
การพิจารณา:
(1) ข้อควรพิจารณาที่คล้ายกันใช้เมื่อ จำกัด จำนวนเซลล์ทั้งหมดในตัวอย่างเซลล์, เนื่องจาก DNA ที่ไม่ใช่เป้าหมายภายในสารโมเลกุลขนาดใหญ่อื่น ๆ อาจส่งผลต่อการทดลอง.
(2) หมายเหตุเตือนสำหรับการควบคุมคุณภาพ (QC): การสุ่มตัวอย่างไม่ควรมากเกินไป. ในขณะที่การเพิ่มปริมาณการทดสอบอาจเป็นที่ต้องการสำหรับการเป็นตัวแทนใน QC, ควรใช้ความระมัดระวังในกรณีดังกล่าว.
(3) สิ่งสำคัญคือต้องเข้าใจตัวอย่างของเรา; หากมีตัวทำละลายอินทรีย์หรือไอออนโลหะที่ยับยั้งเอนไซม์, เราจำเป็นต้องยืนยันว่าสารเหล่านี้สามารถกำจัดได้อย่างมีประสิทธิภาพก่อนการทดลองหรือไม่หรือหากความเข้มข้นของพวกเขาสามารถลดลงได้ด้วยวิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์.
(4) การปนเปื้อนจากกรดนิวคลีอิกอื่น ๆ เป็นปัจจัยรบกวนที่พบบ่อย.
โดยเฉพาะ, เมื่อจัดการ Chlamydia หรือ Chlamydia ตัวอย่างที่เป็นบวก vortexing, อาจมีการสร้างสเปรย์. เพราะฉะนั้น, ในระหว่างการสอบ Chlamydia, การดำเนินการปลอดเชื้ออย่างเข้มงวดภายในตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพเป็นสิ่งสำคัญ, และการหมุนเหวี่ยงอย่างรวดเร็วหลังจากแนะนำให้ใช้กระแสน้ำวน.
ขั้นตอนการสกัดดีเอ็นเอ
การสกัดดีเอ็นเอเกี่ยวข้องกับเพียงสองขั้นตอน: การสลายเซลล์และการทำให้บริสุทธิ์.
- เซลล์ lysis เซลล์ lysis จะแบ่งโครงสร้างของเซลล์ตัวอย่างลง, ปล่อย DNA และส่วนประกอบเซลล์อื่น ๆ ลงในโซลูชัน. วิธีการสำหรับการสลายดีเอ็นเอรวมถึงเครื่องจักรกล, เคมี, และกระบวนการเอนไซม์.
- วิธีการทางกลมักจะเกี่ยวข้องกับการบดไนโตรเจนเหลว.
- วิธีการทางเคมีเช่น CTAB และ เอกสารความปลอดภัย ตั้งเป้าหมายที่จะละลายเยื่อหุ้มเซลล์. CTAB ทำหน้าที่เป็นเครื่องทำความสะอาดประจุบวก, ในขณะที่ SDS เป็นน้ำยาทำความสะอาดประจุลบ, ทั้งการช่วยเหลือในการสลายตัวของเยื่อหุ้มเซลล์. น้ำยาทำความสะอาดโปรตีน denature, รบกวนโครงสร้างเมมเบรนและปล่อยโปรตีนที่เชื่อมต่อกับกรดนิวคลีอิก.
- การกระทำของเอนไซม์, เช่นการย่อยอาหารโดย protease ke k.
การพิจารณา:
(1) สำหรับเป้าหมายการตรวจจับผลิตภัณฑ์บำบัดเซลล์ของเรา, โดยเฉพาะอย่างยิ่ง supernatants เซลล์, การย่อยอาหารของเอนไซม์เป็นวิธีที่อ่อนโยนและง่ายกว่า.
(2) กิจกรรมของเอนไซม์ได้รับอิทธิพลจากปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมเช่นอุณหภูมิและไอออนเกลือ. การทำความเข้าใจตัวอย่างเริ่มต้นเป็นสิ่งสำคัญเพื่อหลีกเลี่ยงผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นจากตัวทำละลายอินทรีย์หรือไอออนเกลือระดับความเข้มข้นสูง. อาจมีการเพิ่มบัฟเฟอร์เพื่อสร้างสภาพแวดล้อมพื้นหลังที่เหมาะสม.
การทำให้บริสุทธิ์การทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอแยก DNA ออกจากส่วนประกอบเซลล์อื่น ๆ เช่นโปรตีน, ไขมัน, โพลีแซคคาไรด์, และ RNA.
เมื่อโครงสร้างเซลล์ถูก lysed, วิธีการพื้นฐานในการแยก DNA ขึ้นอยู่กับการใช้ประโยชน์จากความแตกต่างในคุณสมบัติทางกายภาพและทางเคมีระหว่าง DNA และส่วนประกอบอื่น ๆ เช่น RNA, โปรตีน, และไขมัน.
- DNA มีความสามารถในการละลายต่ำสุดในสารละลาย 0.14mol/L NaCl. การละลาย DNA ในสารละลายความเข้มข้นของเกลือสูงสามารถขจัดสิ่งสกปรกที่ไม่ละลายในเกลือสูง. การตกตะกอน DNA โดยใช้สารละลายเกลือต่ำจะช่วยกำจัดสิ่งสกปรกที่ละลายได้ในเกลือต่ำ.
- โปรตีนส่วนใหญ่มีความทนทานต่ออุณหภูมิระหว่าง 60-80 ℃, ในขณะที่ DNA denatures สูงกว่า 80 ℃.
- DNA ไม่ละลายในแอลกอฮอล์, แต่โปรตีนบางชนิดภายในเซลล์สามารถละลายได้.
การพิจารณา:
(1) การทำความเข้าใจประเด็นเหล่านี้ช่วยให้เข้าใจวิธีการทำให้บริสุทธิ์ต่างๆ.
(2) เมื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของการสกัดและการทำให้บริสุทธิ์, การปรับเปลี่ยนหรือเพิ่มเติมในขั้นตอนที่เฉพาะเจาะจงอาจมีความจำเป็นตามหลักการทดลอง.
วิธีการสกัดดีเอ็นเอทั่วไปสำหรับการตรวจดีเอ็นเอ Chlamydia, การทำความเข้าใจวิธีการตรวจสอบกระแสหลักที่เสนอโดย Chlamydia Test Kit Kit ผู้ผลิตเป็นสิ่งสำคัญ. วิธีการทั่วไปรวมถึงวิธีการตามลูกปัดและวิธีการตกตะกอน. วิธีการกรอง, เนื่องจากต้นทุนที่สูงขึ้น, ปัจจุบันยังไม่ได้รับการพิจารณา, ในขณะที่พิจารณาค่าใช้จ่าย, วิธีคอลัมน์ Centrifuge อาจเป็นความชอบส่วนตัว.
วิธีการตกตะกอนวิธีการตกตะกอนเกี่ยวข้องกับการสกัดฟีนอล/คลอโรฟอร์มเพื่อกำจัดโปรตีนและเอทานอล/ไอโซโพรพานอลเพื่อตกตะกอนดีเอ็นเอ. ฟีนอลสารสกัดโปรตีน denatured จากเฟสน้ำ, การยับยั้งการสลายตัวของดีเอ็นเอโดย DNases. คลอโรฟอร์มเร่งการแยกเฟสอินทรีย์และน้ำ, การลบฟีนอลที่เหลืออยู่.
การพิจารณา:
(1) ความกลัวของคลอโรฟอร์มทำให้ฉันรู้สึกไม่สบายใจนอกฮูดควัน.
(2) พิจารณาความสามารถในการจัดการปริมาณตัวอย่างขนาดใหญ่, ฉันมีแนวโน้มที่จะลองวิธีนี้.
(3) มีความกังวลเล็กน้อยว่าวิธีการตกตะกอนอาจตกตะกอนสิ่งสกปรก, ดังนั้นจำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติม.
วิธีคอลัมน์เครื่องหมุนเหวี่ยง
วิธีนี้เกี่ยวข้องกับโซลูชันที่มีผลผูกพันที่ไม่ซ้ำกัน/proteas. DNA จีโนมเลือกใช้เมมเบรนที่ใช้ซิลิกอนภายในคอลัมน์เครื่องหมุนเหวี่ยงในสถานะเกลือสูง. ผ่านขั้นตอนการล้างและการหมุนเหวี่ยงอย่างรวดเร็ว, สารยับยั้งจะถูกลบออกไปพร้อมกับเมตาโบไลต์ของเซลล์และโปรตีน, ทิ้งดีเอ็นเอจีโนมที่บริสุทธิ์, ซึ่งจะถูกชะออกจากเมมเบรนที่ใช้ซิลิคอนโดยใช้บัฟเฟอร์การกำจัดเกลือต่ำ.
การพิจารณา:
(1) ค่อนข้างปลอดภัย, แต่ปริมาณตัวอย่างอาจต่ำไปหน่อย.
(2) ปริมาณที่ จำกัด ของหลอดคอลเลกชัน จำกัด พื้นที่การปฏิบัติงาน.
(3) เพื่อให้แน่ใจว่าตรวจจับ, ดีเอ็นเอจะต้องเข้มข้น, ซึ่งจะช่วยลดปริมาณการปิเปต. การควบคุมปิเปตเป็นสิ่งสำคัญ.
(4) พิจารณาค่าใช้จ่าย, วิธีคอลัมน์ Centrifuge เป็นตัวเลือกชั่วคราว.
วิธีลูกปัดแม่เหล็ก
ขั้นตอนหลักของวิธีลูกปัดแม่เหล็กเกี่ยวข้องกับ lysis, ผูกพัน, ซักผ้า, และการชะล้าง. ขั้นตอนเฉพาะไม่ได้มีรายละเอียดที่นี่.
บัฟเฟอร์ lysis ที่ใช้ในวิธีนี้ denatures โปรตีน, ทำให้เซลล์ lysis และ denaturation ของโปรตีนที่ถูกผูกไว้กับ DNA. ลูกปัดแม่เหล็กดูดซับ DNA โดยเฉพาะ. ผ่านการซักผ้า, สิ่งสกปรกเช่น RNA และโปรตีน, นอกเหนือจาก DNA, จะถูกลบออก. แล้ว, วิธีแก้ปัญหาการชะ, ส่งผลให้ดีเอ็นเอที่บริสุทธิ์และเข้มข้นสูงสำหรับ พีซีอาร์ การขยายเสียง.
วิธีลูกปัดแม่เหล็กผสมผสานนาโนเทคโนโลยีและเทคโนโลยีชีวภาพ, การใช้อนุภาคนาโนแม่เหล็กส่วนใหญ่ประกอบด้วยวัสดุที่ใช้งานทางชีวภาพที่แสดงถึง paramagnetism. ลูกปัดเหล่านี้มีเลเยอร์พื้นผิวที่สามารถแลกเปลี่ยนประจุบวกได้, อำนวยความสะดวกในการดูดซับกรดนิวคลีอิก. วัสดุพื้นผิวจับกับกรดนิวคลีอิกผ่านพันธะไฮโดรเจนและปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิต. หลักการทำให้บริสุทธิ์นั้นเกี่ยวข้องกับกรดนิวคลีอิกที่มีผลผูกพันในสภาวะที่มีเกลือสูงและกำจัดพวกมันในสภาพแวดล้อมที่มีเกลือต่ำ. นอกจากนี้, ลูกปัดแม่เหล็กรวมหรือกระจายอยู่ภายใต้สภาวะสนามแม่เหล็ก, ไม่จำเป็นต้องดำเนินการด้วยตนเองเช่นการหมุนเหวี่ยง.
การพิจารณา:
(1) ปมของวิธีลูกปัดแม่เหล็กอยู่ในลูกปัด. ชุดบางส่วนมีจำนวนลูกปัดจำนวน จำกัด, การกระตุ้นให้ผู้เชี่ยวชาญสร้างระบบของตนเอง. รอคอยความสำเร็จของพวกเขา.
(2) เมื่อเลือกขาตั้งแม่เหล็ก, เลือกที่มองเห็นได้.
การประเมินความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ
หลังจากการสกัดดีเอ็นเอ, ประเมินความบริสุทธิ์, ความเข้มข้น, และความซื่อสัตย์เป็นสิ่งจำเป็น. วิธีการทั่วไปได้แก่:
- เจลอิเล็กโทรโฟเรซิส: วิธีนี้ใช้เจล agarose เพื่อกำหนด RNA ที่เหลือ, โปรตีน, ฟีนอล, หรือสารอื่น ๆ ใน DNA ที่สกัด. นอกจากนี้, ความสว่างของวงดนตรีแสดงถึงความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ. เจลอิเล็กโทรโฟเรซิส, โดยการเปรียบเทียบความสว่างของวงกับเครื่องหมาย DNA, ประมาณความเข้มข้นของดีเอ็นเอประมาณ.
- สเปคโตรโฟโตเมตรี: วงแหวนเบนซีนของ DNA หรือ RNA ฐานดูดซับอย่างมากในช่วงอัลตราไวโอเลตที่ 260nm. โปรตีนแสดงการดูดซึมสูงสุดที่ 280nm, ในขณะที่เกลือและโมเลกุลขนาดเล็กมีสมาธิที่ 230nm. ใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์, หลักการคือการดูดซับมีความสัมพันธ์กับความเข้มข้นของดีเอ็นเอ. การประเมินความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอมักเกี่ยวข้องกับการวัด OD260, OD280, และค่า OD230, ตัดสินความบริสุทธิ์ตามอัตราส่วนของพวกเขา.
โดยปกติ, DNA บริสุทธิ์มีอัตราส่วน OD260/OD280 อยู่รอบ ๆ 1.8. อัตราส่วนด้านบน 1.9 แนะนำการย่อยสลายของดีเอ็นเอหรือการปนเปื้อนของ RNA, ในขณะที่ด้านล่าง 1.7 บ่งบอกถึงเศษโปรตีน. เจลอิเล็กโทรโฟเรซิสมักจะดำเนินการในขั้นต้นเพื่อประเมินความบริสุทธิ์และความสมบูรณ์, ตามด้วย UV spectrophotometry เพื่อวัดความเข้มข้น.
วิธีการตรวจจับ QBIT
เทคนิคนี้ใช้สีย้อมฟลูออเรสเซนต์ที่ปล่อยฟลูออเรสเซนต์เมื่อจับกับโมเลกุลเป้าหมายเฉพาะ. เครื่องมือวัดค่าฟลูออเรสเซนต์และแปลงเป็นข้อมูลความเข้มข้น. เมื่อเทียบกับ spectrophotometry, วิธีนี้มีความอ่อนไหวมากขึ้น, เฉพาะเจาะจง, และแม่นยำในการตรวจจับ.
การพิจารณา:
(1) พิจารณาค่าใช้จ่าย, วิธีการ 1.5.1 และ 1.5.2 ขณะนี้มีความสะดวกมากขึ้นในระหว่างการพัฒนาวิธีการสกัด.
(2) เพื่อยืนยันประสิทธิภาพของการสกัด, จำเป็นต้องมีมาตรการควบคุมคุณภาพที่ตามมา. เมื่อพัฒนาวิธีการอย่างอิสระ, การเลือกการควบคุมคุณภาพที่มีประสิทธิภาพเป็นสิ่งจำเป็น.
ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับการสกัดดีเอ็นเอและรีเอเจนต์การทำให้บริสุทธิ์
ฉันได้รวบรวมบทสรุปของรีเอเจนต์ต่าง ๆ ที่อาจใช้เพื่อความเข้าใจที่ดีขึ้น. การรวบรวมนี้มีวัตถุประสงค์อ้างอิง, ไม่ใช่ต้นฉบับ, มีวัตถุประสงค์เพื่อแลกเปลี่ยนการศึกษาเพียงอย่างเดียว.
โปรตีเอส K โปรตีน K, แยกได้จากเชื้อราสีขาว, เป็นเอนไซม์ย่อยโปรตีนที่มีศักยภาพที่มีกิจกรรมเฉพาะสูง, สิ่งสำคัญสำหรับการสกัดดีเอ็นเอ. มันยังคงทำงานอยู่ภายในช่วง pH ในวงกว้าง (4-12.5) และที่อุณหภูมิสูง (50-70 องศาเซลเซียส). ตัวแทน chelating เช่น EDTA หรือตัวแทน deionizing เช่น SDS ไม่ปิดใช้งาน.
โปรตีนเค, โปรตีเอสซีรีนที่มีกิจกรรมความแตกแยกในวงกว้าง, ตัดพันธะเปปไทด์ที่ปลายคาร์บอกซิลของกรดอะมิโนอะลิฟาติกและอะโรมาติก. มันย่อยโปรตีนเมมเบรนต่าง ๆ และ glycoproteins บนเซลล์และเยื่อหุ้มนิวเคลียร์และยังย่อยฮิสโตนที่ถูกผูกไว้กับ DNA.
โซเดียมคลอไรด์ (โซเดียมคลอไรด์) NaCl ช่วยในการกำจัดโปรตีนที่ถูกผูกไว้กับ DNA. โดยการทำให้ประจุลบกับ DNA เป็นกลาง, ช่วยให้โมเลกุลรวมและทำให้โปรตีนละลายในชั้นน้ำ, ป้องกันการตกตะกอนด้วย DNA ในแอลกอฮอล์.
ความเข้มข้นของเกลือมีบทบาทสำคัญเมื่อเซลล์สัมผัสกับสารละลาย hypotonic หรือ hypertonic, นำไปสู่การออสโมซิส.
EDTA EDTA chelates divalent cation เช่น MG2+ และ Ca2+, ซึ่งมีอยู่ในเอนไซม์, การลดกิจกรรมของเอนไซม์ของ DNases และ RNASES. เช่น, เอนไซม์ DNase ต้องการ Mg2+ ไอออนเป็นปัจจัยร่วมสำหรับกิจกรรมของพวกเขา. chelating mg2+ ions พร้อม EDTA ทำให้ DNase ไม่ทำงาน, ปกป้อง DNA. นอกจากนี้ยังจำเป็นต้องมีแมกนีเซียมไอออนสำหรับการรวมตัวของโปรตีนกรดนิวคลีอิก, ในขณะที่แคลเซียมไอออนเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับความสมบูรณ์ของผนังเซลล์และเสถียรภาพของเมมเบรน.
ฟีนอล, ตัวทำละลายอินทรีย์ไม่ละลายน้ำในน้ำ, ใช้กับคลอโรฟอร์มและ isoamyl แอลกอฮอล์สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ DNA, การกำจัดสารปนเปื้อนโปรตีนและโพลีแซคคาไรด์. เมื่อเขย่าด้วยสารสกัดจากเซลล์, ส่วนประกอบ nonpolar ของเซลล์จะแยกส่วนในฟีนอล, ทิ้งส่วนประกอบขั้วโลกไว้ในน้ำ. ดีเอ็นเอยังคงไม่ได้รับการแก้ไขในฟีนอลเพราะเป็นตัวทำละลายที่ไม่ใช่ขั้ว. ในทางกลับกัน, โปรตีนมีทั้งกลุ่มขั้วและ nonpolar เนื่องจากกรดอะมิโนที่แตกต่างกันในโซ่ยาวของพวกเขา. การพับของโปรตีนเป็นทุติยภูมิ, ตติยภูมิ, และโครงสร้าง quaternary ก็ขึ้นอยู่กับขั้วกรดอะมิโน.
การหมุนเหวี่ยงกับส่วนผสมของฟีนอล: และคลอโรฟอร์ม:
isoamyl แอลกอฮอล์ในก 25:24:1 อัตราส่วนให้สามชั้น: เกี่ยวกับน้ำ, ระหว่างเฟส, และออร์แกนิก. ดีเอ็นเอ, ประจุลบและขั้วที่เป็นกลางถึงค่า pH อัลคาไลน์, ยังคงชอบน้ำและยังคงอยู่ในเฟสน้ำ. กรดอะมิโนที่ไม่ชอบน้ำในโปรตีนป้องกัน DNA ในสารละลายน้ำ. อย่างไรก็ตาม, เมื่อเทียบกับการสูญเสียสภาพ, กรดนิวคลีอิก nonpolar ถูกเปิดเผย, ทำให้โปรตีนและโพลีแซคคาไรด์บางชนิดตกตะกอนที่ interphase.
การรวมกันของฟีนอล-คลอโรฟอร์มช่วยลดการกระจายของโพลี(ก) และ mRNA ในเฟสอินทรีย์และลดการก่อตัวของคอมเพล็กซ์ RNA-protein ที่ไม่ละลายน้ำที่ interphase. ฟีนอลยังคงอยู่ประมาณ 10-15% ของเฟสน้ำ, ส่งผลให้สูญเสีย RNA คล้ายกัน. คลอโรฟอร์มป้องกันการกักเก็บน้ำ, จึงช่วยเพิ่มผลผลิต.
ควรใช้ฟีนอลที่เป็นกลางเท่านั้นเป็นฟีนอลที่เป็นกรดละลาย DNA, หรือฟีนอล, ผ่านการออกซิเดทีฟ, แปลงเป็น quinones, การสร้างอนุมูลอิสระที่ทำให้กรดนิวคลีอิกเสื่อมสภาพ.
คลอโรฟอร์ม
คลอโรฟอร์มเป็น nonpolar (ไม่ชอบน้ำ) ตัวทำละลายที่โปรตีน nonpolar และไขมันละลาย. สิ่งนี้กระตุ้นให้มีการกระจายของไขมันและเศษเซลล์เข้าสู่เฟสอินทรีย์, ปกป้อง DNA ที่แยกจากกันในเฟสน้ำ. มีความหนาแน่นค่อนข้างสูง (1.47 g/cm³), คลอโรฟอร์มทำให้มั่นใจได้ว่าการแยกของเหลวทั้งสอง, การอนุญาตให้เฟสอินทรีย์และน้ำแยกออกจากกันอย่างชัดเจนและช่วยในการกำจัดเฟสน้ำในขณะที่ลดการปนเปื้อนข้ามด้วยเฟสอินทรีย์. เนื่องจากคลอโรฟอร์มมีความผันผวนโดยเนื้อแท้, ไม่ขัดขวางกระบวนการที่ตามมา.
เสริม: วิธีใช้ฟีนอลและคลอโรฟอร์มสำหรับการสกัดดีเอ็นเอเพื่อกำจัดโปรตีน?
ฟีนอลและคลอโรฟอร์มเป็นโมเลกุลที่ไม่ใช่โพลาร์, ในขณะที่น้ำเป็นโมเลกุลขั้วโลก. เมื่อสารละลายโปรตีน-น้ำผสมกับฟีนอลหรือคลอโรฟอร์ม, โมเลกุลน้ำระหว่างโมเลกุลโปรตีนถูกแทนที่ด้วยฟีนอลหรือคลอโรฟอร์ม, ทำให้โปรตีนสูญเสียสถานะความชุ่มชื้นและการทำลายล้าง. หลังจากการปั่นแยก, โปรตีน denatured, หนาแน่นกว่าน้ำ, แยกออกจากเฟสน้ำและตกตะกอนด้านล่าง, แยกออกจาก DNA ที่ละลายในเฟสน้ำ. ฟีนอลและคลอโรฟอร์ม, เป็นตัวทำละลายอินทรีย์, มีข้อดีและข้อเสียในการกำจัดโปรตีน. ฟีนอลมีผลกระทบที่สำคัญกว่า แต่บางส่วนละลายในเฟสน้ำ, ส่งผลให้สูญเสียประมาณ 10% ถึง 15% ของ DNA ในเฟสน้ำ. ผลการ denaturing ของคลอโรฟอร์มไม่ได้มีประสิทธิภาพเท่ากับฟีนอล, แต่มันไม่ละลายในน้ำ, ดังนั้นจึงไม่พก DNA. ดังนั้น, การรวมกันของฟีนอลและคลอโรฟอร์มให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดในระหว่างกระบวนการสกัด.
isopentanol (ไอโซโพรพานอล)
คลอโรฟอร์มที่สัมผัสกับก๊าซที่เป็นอันตรายในรูปแบบอากาศ, ฟอสยีน. หากใช้คลอโรฟอร์มเท่านั้น, การดักแก๊สนำไปสู่การเกิดฟองหรือเดือด, ทำให้ยากต่อการชำระดีเอ็นเออย่างถูกต้องระหว่างสองเฟส. ณ จุดนี้, การรวมคลอโรฟอร์มกับไอโซโพรพานอลหรือ octanol ป้องกันอิมัลชันของสารละลายในระหว่างกระบวนการสกัด.
อาร์เนส เอ
อาร์เนส เอ เป็น endoribonuclease ที่กระตุ้นการไฮโดรไลซิสของ 3′,5′-พันธบัตรฟอสโฟโดดีสเตอร์ของ RNA ที่ 5′-เอสเตอร์บอนด์ในปฏิกิริยาสองขั้นตอน. ขั้นตอนแรกคือ transphosphorylation, ส่งผลให้การสิ้นสุดของ oligonucleotide สิ้นสุดใน pyrimidine 2′,3′-ฟอสเฟตวัฏจักร. ขั้นตอนที่สองคือการไฮโดรไลซิสของวงจรฟอสเฟตเพื่อผลิตเทอร์มินัล 3-phosphodiester. DNA ขาดความสำคัญ 2′-โอ้, ทำให้ทนต่อการย่อยอาหารโดย RNase A.
isopropanol/ethanol
เอทานอลตกตะกอนดีเอ็นเอจากสารละลายสกัด. ดีเอ็นเอ, ด้วยกระดูกสันหลัง phosphodiester, เป็นหลักที่ชอบน้ำ. โมเลกุลของน้ำก่อตัวเป็นเปลือกไฮเดรชั่นรอบ DNA ผ่านพันธะไฮโดรเจน. isopropanol/เอทานอลใช้ในการตกตะกอน DNA, รบกวนเปลือกไฮเดรชั่น. Isopropanol เป็นตัวเลือกที่ดีสำหรับการตกตะกอน DNA. ต้องใช้ปริมาณที่น้อยกว่า (0.6–0.7 เท่าของปริมาณของ supernatant). อาร์เอ็นเอ, ด้วย 2'oh เพิ่มเติม, มีแนวโน้มที่จะละลายในน้ำได้มากขึ้น, ทิ้งไว้ข้างหลัง DNA. ไอโซโพรพานอลสามารถละลายตัวทำละลายที่ไม่ใช่ขั้วเช่นคลอโรฟอร์ม, จึงลบสิ่งสกปรกออกจากขั้นตอนก่อนหน้า.
โดยทั่วไป, ใช้ไอโซโพรพานอลเย็น, แต่นักวิจัยแนะนำอุณหภูมิห้องเพื่อป้องกันการตกตะกอน polysaccharide. ในขณะที่อุณหภูมิต่ำเพิ่มผลผลิต DNA, พวกเขาอาจเพิ่มสิ่งสกปรก.
ไอโซโพรพานอล (ข้อดี: ต้องใช้ปริมาณน้อยลง, การเร่งรัดอย่างรวดเร็ว, เหมาะสำหรับความเข้มข้นต่ำ, ตัวอย่างดีเอ็นเอที่มีปริมาณสูง; ข้อเสีย: มีแนวโน้มที่จะทำเกลือ coprecipitating ด้วย DNA; ต้องการการล้างหลายครั้งด้วย 70% เอทานอล) เอทานอล (ข้อดี: การตกตะกอนน้อยที่สุดด้วยเกลือ, เอทานอลตกค้างในการตกตะกอนดีเอ็นเอได้ง่าย, ไม่ส่งผลกระทบต่อการทดลองในภายหลัง; ข้อเสีย: ปริมาณโดยรวมที่ใหญ่ขึ้น, ต้องการการจัดเก็บเป็นเวลานานที่ -20 ° C สำหรับการตกตะกอนที่มีประสิทธิภาพ, กำหนดให้มี 70% การล้างเอทานอล)
โซเดียมอะซิเตท/แอมโมเนียมอะซิเตท/โพแทสเซียมอะซิเตท/โซเดียมคลอไรด์/ลิเธียมคลอไรด์/โพแทสเซียมคลอไรด์
เกลือในขั้นตอนการสกัดทำหน้าที่โดยการทำให้ประจุไฟฟ้าของดีเอ็นเอน้ำตาล-ฟอสเฟตเป็นกลาง. โซเดียมอะซิเตทที่ pH 5.2 มักใช้ร่วมกับเอทานอลสำหรับการตกตะกอนของกรดนิวคลีอิก. การแก้ปัญหา, โซเดียมอะซิเตทแยกตัวออกเป็น Na+ และ [CH3COO]- ไอออน. ไอออนโซเดียมที่มีประจุบวกทำให้เกิดประจุลบใน PO3- ของกระดูกสันหลัง-ฟอสเฟตกรดนิวคลีอิก, การลดแรงผลักดันระหว่างโมเลกุล DNA. สิ่งนี้จะช่วยลดความชอบน้ำของโมเลกุล DNA อย่างมีนัยสำคัญ, ดังนั้นการลดความสามารถในการละลายในน้ำอย่างมาก.
เอทานอล
ล้าง DNA ตกตะกอนด้วย 70% เอทานอลเพื่อกำจัดเกลือส่วนเกิน, เครื่องหมุนเหวี่ยง, และทิ้งเอทานอล, ออกจาก DNA ในการตกตะกอน. อากาศแห้งหรือสูญญากาศตกตะกอน. หลีกเลี่ยงการอบแห้งมากเกินไปเนื่องจากอาจทำให้มันท้าทายที่จะละลาย DNA ในภายหลัง.
Tris-Edta (ที่) บัฟเฟอร์/น้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อ
ในวิธีการแยก DNA ก่อนหน้านี้, DNA จำเป็นต้องแห้งและเก็บไว้, จากนั้นเจือจางตามต้องการ. ทุกวันนี้, สำหรับการจัดเก็บระยะยาว, เป็นการรอบคอบที่จะเก็บ DNA ในบัฟเฟอร์ที่รักษาค่า pH และป้องกันการย่อยสลาย. บัฟเฟอร์ TE มีทริส (10 มม) และ EDTA (1 มม), โดยที่ทริสทำหน้าที่เป็นบัฟเฟอร์และ EDTA ในฐานะตัวแทนคีเลต. สำหรับการแยกดีเอ็นเอ, โดยทั่วไปแล้วค่า pH จะถูกตั้งค่าเป็น 7.5-8.5. ความเป็นด่างที่อ่อนแอของบัฟเฟอร์ TE ช่วยป้องกันโอกาสในการไฮโดรไลซิสกรด, ดีเอ็นเอที่มีเสถียรภาพในน้ำ.
ส่วนประกอบของ Tris Amino ใน Buffer Shields DNA โซ่จากความเสียหายจากรังสีในสารละลายที่เป็นของแข็งและของเหลว. เมื่อรังสีสร้างอนุมูลอิสระ, มันอาจเป็นอันตรายต่อโซ่ดีเอ็นเอ. ดังนั้น, ในสารละลายของเหลวที่อุณหภูมิห้อง, ทริสทำหน้าที่โดยการล้างอนุมูลอิสระไฮดรอกซิล.
EDTA ตั้งเป้าหมายที่จะ chelate Mg2+ ไอออนในโซลูชันที่จำเป็นสำหรับกิจกรรม DNase หรือ RNase, ป้องกัน DNA จากการโจมตี DNase หรือ RNase.
น้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อสามารถใช้สำหรับการจัดเก็บดีเอ็นเอระยะสั้น. หากใช้บัฟเฟอร์ TE สำหรับการจัดเก็บ DNA, น้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อควรเจือจางต่อไปเพื่อลดความเข้มข้นของ EDTA. สิ่งนี้ทำให้มั่นใจได้ว่าแมกนีเซียมไอออนมีให้สำหรับกิจกรรมโพลีเมอเรสในช่วง PCR. ส่วนประกอบบัฟเฟอร์ใน TE อาจเป็นอุปสรรคต่อการขยาย DNA หาก DNA จำเป็นต้องจัดลำดับในภายหลัง.
