단백질 제 K는 중요합니다 효소 핵산 제제에서 단백질을 소화하고 제거하기위한 분자 생물학 연구소에 사용. 이 단백질 분해 효소에는 연구 응용 분야에 매우 유용한 핵심 특성이 있습니다.. 이 게시물에서, 우리는 정확히 단백질 제 K가 무엇인지 탐구 할 것입니다, 그것이 어떻게 기능하는지, 실험실에서 많은 용도.
Proteinase k?
Proteinase K는 곰팡이 Tritirachium 앨범에서 분리 된 광범위한 세린 프로테아제입니다.. 단백질을 작은 펩티드 단편 및 아미노산으로 빠르게 소화 할 수 있습니다..
이름 “단백질 제 K” 케라틴을 소화하는 능력에서 비롯됩니다, 모발에서 발견되는 힘든 구조 단백질, 손톱, 깃털, 등. 곰팡이 Tritirachium 앨범은 Keratin이 유일한 질소 공급원으로 제공 될 때 단백질 제 K를 분비합니다..
Proteinase k에 대한 사실은 무엇입니까??
단백질 제에 대한 몇 가지 주요 사실 k:
- 분류: 펩 티다 제 제품군 S8에 속한다 (서브 틸리 신 가족)
- 촉매 유형: 세린 프로테아제
- 최적의 pH:5 – 12.0
- 최적의 온도:50℃ – 65℃
- 분자 무게:28,930 그리고
단백질 제 K는 3 개의 아미노산의 촉매 트라이어드를 함유한다 – 아스파 테이트, 히스티딘, 그리고 세린. 세린은 펩티드 결합을 절단하는 친핵체 역할을한다.. 칼슘 이온은 완전 효소 활성에 중요합니다.
단백질 제 K는 어떻게 작동합니까??
세린 프로테아제로, Proteinase K는 지방족 및 방향족 아미노산의 카르 복실 그룹에 인접한 펩티드 결합의 가수 분해를 촉매한다..
작용 메커니즘은 키모 트립신 및 트립신과 같은 다른 세린 프로테아제의 메커니즘과 유사합니다.. 주요 단계는 다음과 같습니다:
- 효소의 촉매 세린은 펩티드 결합 카르 보닐 탄소에 대한 친 핵성 공격을 시작합니다..
- 이것은 수소 결합에 의해 안정화 된 사면체 중간체를 형성한다.
- 그런 다음 질소-탄소 결합이 파손됩니다, 첫 번째 생성물을 방출하고 아실-효소 중간체를 형성합니다.
- 물 분자는 효소를 비활성화시킨다, 두 번째 제품을 출시합니다.
- 이것은 다른 촉매 라운드에 대한 활성 세린 사이트를 재생합니다..
단백질 분해 효소 K는 내부 펩티드 결합에서 엔도 펩 티다 제로서 단백질을 절단한다.. 그것은 엄격한 특이성을 가지고 있지 않지만 큰 소수성 잔기를 선호합니다.. 이것은 대부분의 단백질을 더 작은 조각으로 빠르게 분해 할 수있게합니다..
단백질 제 K에 사용되는 것은 무엇입니까??
Proteinase K는 분자 생물학 연구의 필수 시약이되었습니다.. 가장 일반적인 용도는 다음과 같습니다:
오염 단백질 소화
세포 및 조직으로부터 DNA 또는 RNA를 분리 할 때, 단백질 분해 효소 K는 오염 단백질을 소화하는 데 사용됩니다. 이것은 핵산 제제에서 불순물을 제거합니다. 와 같은 세제 추가 SDS 강화 된 소화를 위해 단백질을 노출시키는 데 도움이됩니다.
비활성화 뉴 클레아 제
DNA와 RNA를 분해 할 수있는 많은 뉴 클레아 인은 단백질 자체입니다.. Proteinase K는 단백질 분해 절단에 의해 이들 유해한 뉴 클레아 제를 빠르게 불 활성화시킨다.. 이것은 분리 된 핵산을 분해로부터 보호합니다.
조직 소화
단백질 분해 효소 K는 세포를 분리하고 조직을 가용화하는 데 도움이 될 수 있습니다, 추출을위한 핵산 방출. DNA/RNA 정제 프로토콜을위한 조직 용해 완충제에 포함되어 있습니다..
단백질 분석
프로테아제는 단백질 구조에 대한 정보를 제공하는 특정 펩티드 단편을 생성합니다.. Proteinase K 소화 패턴은 단백질 도메인 연구에 유용합니다., 수정 사이트, 등.
비활성화 전염성 프리온
엔도 펩티다 제로, Proteinase K는 Creutzfeldt-Jakob 질병과 같은 전염성 해면 뇌병증을 담당하는 잘못 접힌 프리온 단백질을 소화 할 수 있습니다.. 프리온 오염을 비활성화하는 데 사용됩니다.
DNA 시퀀싱
일부 DNA 시퀀싱 방법 Proteinase K를 사용하여 서열 연장 후 DNA 폴리머 라제를 제거합니다., 전기 영동을위한 DNA 준비.
현장 하이브리드 화
효소는 RNA 및 DNA 완전성을 보존하는 동안 뉴클레오티드 프로브의 혼성화를 위해 고정 세포/조직을 부드럽게 투과시킬 수 있습니다..
단백질 제 K에는 어떤 조건이 필요합니까??
다음은 Proteinase K가 제대로 기능 해야하는 조건입니다..
온도
단백질 분해 효소 K는 50 ℃ 내지 65 ℃로 높은 활성을 나타낸다, 최적의 온도는 약 60 ° C입니다. 37 ℃에서도 일부 단백질 분해 능력을 유지한다. 더 높은 온도는 단백질 구조에 더 접근 할 수있게 만들 가능성이 높습니다.
pH
이 효소는 pH에서 넓은 pH 범위에서 기능합니다. 4 pH에 12, pH 사이의 최대 활성 7.5 그리고 12. 알칼리성 조건이 가장 좋습니다, 그러나 중립 pH도 잘 작동합니다.
세제
SDS와 같은 이온 세제 첨가 (나트륨 도데실 황산염) 단백질 기질을 변성시킴으로써 단백질 제 K 활성을 향상시킬 수있다. 비 이온 세제와 같은 트리톤 X-100 또한 작동합니다.
이성 양이온
단백질 제 K는 완전 효소 활성 및 안정성을 위해 칼슘 이온이 필요합니다.. EDTA는 칼슘을 키우고 효소를 억제 할 수 있습니다. 하지만, 단백질 분해 효소 K는 여전히 칼슘없이 일부 기능을 유지합니다.
Proteinase K는 실험실에서 어떻게 사용됩니까??
Proteinase K는 실험실에서 중요한 기능을 가지고 있으며 다음 방법으로 실험실에서 사용됩니다.:
단백질 제 K 완충 레시피
전형적인 단백질 제 K 소화 완충제가 포함됩니다:
- 10 mm 트리스-HCl pH 8.0
- 100 mM NaCl
- 5% SDS
- 50 μg/ml 단백질 제 K
트리스는 주변의 알칼리성 pH를 유지합니다 8.0. NaCl은 약간의 이온 강도를 제공합니다. 소화를위한 SDS 거부 단백질. 버퍼는 필요에 따라 수정 될 수 있습니다.
소화 프로토콜
- 사용 직전에 단백질 제 K를 완충제에 추가하십시오.
- 완충액에서 샘플을 배양하십시오 30 최소 2 50 ℃ 내지 65 ℃에서의 HR.
- 95 ℃에서 가열함으로써 단백질 분해 효소 K를 불 활성화시킨다 10 최소 또는 PMSF 사용.
더 긴 소화 또는 온도가 높으면 활동이 증가 할 수 있습니다. 샘플 컨텍스트는 최적의 조건을 지시합니다.
주의!
단백질 제 K는 매우 강력한 프로테아제입니다. 분석 할 샘플을 오염시키는 샘플 또는 분해 단백질을 피하기 위해주의를 기울여야합니다.. 항상 장갑을 착용하고 전용 용품을 사용하십시오.
단백질 제 K는 어떻게 불 활성화됩니까??
일단 Proteinase K가 그 목적을 달성했을 때, 추가 소화를 멈추기 위해서는 비활성화되어야합니다. 몇 가지 방법이 있습니다:
- 난방: 90 ° C 이상의 온도는 효소를 빠르게 불 활성화시킵니다. 하지만, 가열은 잔류 활동을 완전히 제거하지 않습니다.
- PMSF: 이 돌이킬 수없는 세린 프로테아제 억제제 공유 촉매 세린을 공유 적으로 수정합니다., 영구적으로 차단 활동.
- aebsf: 단백질 제 K를 영구적으로 비활성화하는 다른 세린 프로테아제 억제제.
- TCA: 트리클로로 아세트산 거부 및 효소를 침전시킨다.
가열은 가장 편리한 방법입니다, 그러나 세린 프로테아제 억제제는 완전한 불 활성화를 제공한다.
단백질 분해 효소 K에 대한 몇 가지 대안은 무엇입니까??
단백질 제 K의 일부 대안은 다음을 포함한다:
- Pronase: Streptomyces griseus로부터 분리 된 비특이적 프로테아제 믹스.
- 트립신: 라이신과 아르기닌에 특이성을 가진 세린 프로테아제.
- 펩신: 포유류 위 주스로부터의 아스파르트로 프로테아제. 산성 조건에서 가장 잘 작동합니다.
- 파파인: 파파야의 시스테인 프로테아제. 종종 세포 해리에 사용됩니다.
각각 분해 단백질에서 단백질 제 K와 약간의 중복이 있습니다., 그러나 그들의 특정 속성은 다릅니다. Proteinase K는 여전히 일반적인 실험실 목적으로 가장 널리 사용됩니다..
결론
강력한 세린 프로테아제 단백질 효소 K는 분자 생물학 연구 및 진단에 필수적입니다.. 가혹한 조건에서 활성으로 남아 단백질을 빠르게 소화하는 놀라운 능력은 오염 단백질을 제거하고 핵산을 보호하기위한 효소가됩니다..
단백질 제 K가 무엇인지 이해합니다, 그것이 어떻게 기능하는지, 최적의 근무 조건은 연구원들이 실험실에서 잠재력을 최대한 활용할 수 있도록합니다.. 이 다재다능한 프로테아제는 간섭 단백질을 제거하고 유해한 뉴 클레아 제를 불 활성화하여 최고 순도의 DNA 및 RNA를 회복함으로써 수많은 기술을 계속 가능하게합니다..
