PCR-SSCP 란 무엇입니까?? 응용 프로그램 및 전체 가이드

분자생물학 기술의 발달로, 유전자 구조와 돌연변이를 검출하는 다양한 방법이 지속적으로 등장하고 있다.. 특히 등장 이후에는 PCR 기술, PCR과 결합된 다양한 유전자 검출 기술은 유전자 연구의 발전을 더욱 촉진시켰습니다.. 비대칭 PCR 산물의 직접 시퀀싱과 같은 기술, 리보뉴클레아제 절단 (RNAse), 및 제한 단편 길이 다형성 분석 (RFLP) 유전자 분석을 위한 강력한 도구가 되었습니다.. 하지만, 이러한 방법은 작동하기가 상대적으로 번거롭습니다., 상당한 한계가 있다, 또는 높은 실험 조건이 필요함, 일반 임상 실험실에는 적합하지 않습니다..

에서 소개 1989, PCR-SSCP (단일 가닥 형태 다형성) 지속적인 개선과 개선을 거쳤습니다., 더 간단하게 만드는 것, 더 빠르게, 유전자 돌연변이를 검출하는 보다 민감한 방법. 점 돌연변이와 짧은 서열 삭제 및 삽입을 검출하는 데 사용될 뿐만 아니라 DNA 정량에도 적용됩니다., PCR 진단 실험에서 교차 오염 모니터링, 그리고 감염원 조사. SSCP의 탁월한 장점으로 인해, 그것은 최근 몇 년 동안 널리 적용되었습니다..

SSCP의 원리와 특성

• 발견 및 기본 개념:
  • 단일 가닥 DNA (SSDNA) 조각은 분자 내 상호 작용에 의해 유지되는 복잡한 공간 접힘 형태를 나타냅니다., 주로 염기쌍.
  • 단일 염기 변화로 공간 구조가 크게 또는 약간 변경될 수 있습니다., 폴리아크릴아미드 겔에서 다른 이동 패턴이 발생함.
• 분리 메커니즘:
  • 비변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (페이지) 겔의 다양한 수준의 방해로 인해 서로 다른 형태의 ssDNA 분자를 뚜렷하게 분리할 수 있습니다..
• SSCP 분석:
  • 명명된 단일 가닥 형태 다형성 (SSCP) 일본 연구원 Orita와 동료들.
  • PCR 증폭산물의 유전자 돌연변이 검출에 적용, 단순성과 감성을 강화하다.
• 기본 프로세스:
  1. PCR 증폭: 표적 DNA 증폭.
  2. 변성과 재생: 특정 PCR 산물을 변성시키고 신속하게 변성시켜 특정 공간 구조를 갖는 단일 가닥 DNA 분자를 형성합니다..
  3. 비변성 PAGE: 적당량의 단일 가닥 DNA에 대해 비변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행합니다..
  4. 발각: 방사선 자가방사선 촬영을 이용한 결과 분석, 은염색, 또는 에티듐 브로마이드 염색.
• 해석:
  • 정상 대조군과 비교하여 ssDNA의 이동 속도의 변화는 구조의 변화를 나타냅니다., 해당 DNA 단편에 염기 돌연변이가 있음을 시사.
• 장점:
  • 단순한, 빠른, 민감한 방법.
  • 전문 장비가 필요하지 않습니다..
  • 임상 실험실에 적합.
• 제한사항:
  • 돌연변이만 감지합니다.; 돌연변이의 정확한 위치와 유형을 정확히 찾아내려면 추가 시퀀싱이 필요합니다..
  • 엄격한 전기영동 조건 필요.
  • 점 돌연변이가 ssDNA 형태를 크게 변경하지 않거나 다른 조건이 방해하는 경우 거짓 음성이 발생할 수 있습니다..
• 탐지 효율성:
  • 한계에도 불구하고, SSCP는 다른 방법에 비해 높은 탐지율을 자랑합니다..
  • 표적 DNA 단편 내 알려지지 않은 염기 돌연변이 식별 가능.
  • Takao는 SSCP가 탐지할 수 있음을 시연했습니다. 90% 보다 짧은 DNA 단편의 단일 염기 돌연변이 300 bp.
• 추가 응용:
  • SSCP는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 이동 속도가 다른 돌연변이 ssDNA를 분리할 수 있습니다..
  • 서열 수준에서 돌연변이 DNA 단편의 추가 정제 및 식별이 가능합니다..

SSCP 개발 및 개선

• 초기 개발:
  • 처음에는, SSCP는 동위원소를 PCR 증폭 산물에 포함시키는 것과 관련이 있습니다., 그리고 그 결과는 방사선 사진을 통해 표시되었습니다.. 이로 인해 광범위한 채택이 어려워졌습니다..
• 단순화:
  • PCR-SSCP와 DNA 은염색의 조합, 특히 직접적인 ethidium bromide 염색의 적용, 방법을 크게 단순화했습니다..
• 최근 주목할 만한 개선 사항:
  • RNA-SSCP 분석:
    • 기본 원리: RNA는 더 복잡한 2차 및 3차 구조를 가지고 있습니다., 단일 염기 돌연변이에 매우 민감하게 만듭니다., 따라서 탐지율이 높아집니다..
    • 돌연변이 탐지율은 다음을 초과할 수 있습니다. 90%.
    • RNA는 이중 가닥을 형성하는 경향이 적습니다., 전기영동에 더 많은 양을 사용할 수 있습니다., ethidium bromide 염색에 도움이 됩니다..
    • 하지만, 이 방법은 역전사 단계를 추가하고 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 더 긴 프라이머가 필요합니다., 복잡성 증가.
• SSCP와 다른 돌연변이 탐지 방법의 결합:
  • 이종이중 분석 (그것):
    • SSCP와 결합하면 탐지율이 크게 향상됩니다..
    • 프로브를 표적 ssDNA 또는 RNA와 혼성화하는 것과 관련됩니다.. 불일치하는 염기쌍을 포함하는 하이브리드 가닥은 비변성 PAG 겔에서 전기영동을 통해 완전히 상보적인 하이브리드 가닥과 분리될 수 있습니다..
    • 동일한 표적 서열에 대해 SSCP와 Het 분석을 모두 수행하면 거의 비슷한 결과를 얻을 수 있습니다. 100% 점 돌연변이 검출률, 실험의 단순성을 유지하면서.

PCR-SSCP 절차

DNA 단편 길이에 따른 겔 준비

1Kb보다 짧은 DNA 단편의 경우, 다음과 같이 폴리아크릴아미드 겔의 농도를 선택하십시오.:

• DNA 단편 길이 (bp): % 아크릴아미드 농도
  • 1Kb–700b: 3.5%
  • 700b–500b: 5%
  • 500b–200b: 8%
  • 200비: 12%

SSCP 이전 준비

• PCR 증폭: 최소한의 번짐으로 특정 제품을 증폭시킵니다. (아가로스겔 전기영동으로 확인).

1. 폴리아크릴아미드 겔의 제조 (PAG)

• 위의 표에서 필요한 농도에 따라 겔 용액을 준비합니다..
• 젤 몰드에 빗을 삽입하세요..
• 빗의 한쪽 끝에서 젤 용액을 붓습니다., 젤이 빗살에 도달할 때 거품 형성을 방지하기 위해 몰드를 붓는 끝쪽으로 기울입니다..
• 젤을 실온에서 굳혀주세요. 1 시간.
• 빗을 제거하고 젤 위에 1×TBE 버퍼를 추가하여 덮습니다..

2. 전기영동

1. 가져가다 10 PCR 생성물의 μl.
2. 추가하다 10 변성제의 μl (95% 포름아미드, 10 mmol/L EDTA, 0.02% 브로모페놀블루).
3. 추가하다 30 미네랄 오일의 μl.
4. 삶다 5 분, 그런 다음 즉시 얼음 욕조에 최소한 2 분.
5. 전체 수성상을 젤에 로드합니다..
6. 10-15°C에서 전기영동을 수행합니다.:
   • 300V부터 시작하세요. 5 분.
   • 120V로 계속 8 시간.
7. 전기영동 후, 1×TBE 완충액에 젤을 염색합니다. 0.5 μg/ml 에티듐 브로마이드 30-45 분.
8. UV 조명 아래에서 관찰하거나 Silver Staining을 진행합니다..

3. 은색 염색

1. PAG를 탈이온수로 두 번 세척합니다..
2. 젤을 용액에 고정하세요. 10% 에탄올과 0.5% 아세트산 6 분.
3. 탈이온수로 2회 세척.
4. 몰입하다 0.2% 질산은 (AgNO3) 솔루션 10 분.
5. 씻다 3-5 탈이온수를 사용하는 경우.
6. 솔루션으로 개발 1.5% 수산화나트륨 (NaOH) 그리고 0.4% 포름알데히드 7 분.
7. 개발을 중단하세요 0.75% 탄산나트륨 (NaCO3).

SSCP의 응용

Orita와 동료들은 인간 DNA 다형성 분석에 SSCP를 사용한 이후, 이 방법은 다양한 분야에서 광범위하게 사용되어 왔습니다., 암 및 유전질환과 관련된 유전자 돌연변이의 검출을 포함, 바이러스 유형 및 오염 모니터링뿐만 아니라.

암 유전자 돌연변이 검출

• 종양 관련 돌연변이:
  • SSCP는 성상세포종 등 다양한 암과 관련된 유전자의 돌연변이를 검출하는 데 널리 사용됩니다., 뇌종양, 소세포폐암, 위암, 그리고 대장암.
  • 이는 이러한 종양의 P53 유전자 돌연변이와 폐암의 ras 유전자 돌연변이를 검출하는 데 적용되었습니다..
• 성공적인 신청:
  • 최근에, 수가노 외. 은으로 염색된 SSCP를 성공적으로 사용하여 위치에서 돌연변이를 탐지했습니다. 12 c-Ki-ras2 유전자의, 내에서 전기영동 및 염색 과정을 완료합니다. 2.5 시간.

유전병 연구

• SSCP는 다음과 같은 유전병과 관련된 유전자 연구에 사용됩니다.:
  • 낭포성 섬유증: CFTR 유전자의 돌연변이 검출.
  • 신경섬유종증 유형 1: 유전자 돌연변이 분석.
  • 가족성 선종성 폴립증: 이 질환과 관련된 유전자 연구.
• RNA-SSCP 대. DNA-SSCP:
  • Sharkar 등. RNA-SSCP를 사용하여 유전자 서열을 검출했습니다. 28 혈우병 B 환자.
  • DNA-SSCP와 직접 유전자 서열분석 비교 밝혀 20 2.6kb Factor IX 유전자의 염기 돌연변이, RNA-SSCP 검출로 70% 이들 돌연변이에 비해 35% DNA-SSCP에 의해 검출됨, RNA-SSCP의 더 높은 민감도 입증.

바이러스 유형 및 오염 모니터링

• 바이러스 타이핑:
  • SSCP는 PCR 실험에서 바이러스 유형 분석 및 오염 모니터링에 사용됩니다..
  • YaP는 중첩된 PCR을 사용하여 다양한 지역의 HBV 샘플을 감지했습니다., 이어서 SSCP 분석, 각 샘플에 대해 고유한 SSCP 패턴이 밝혀졌습니다., HBV DNA의 지역적 변이를 나타내며 교차 오염 가능성을 제거합니다..
• 오염 모니터링:
  • SSCP는 PCR 진단 결과의 정확성을 보장하는 신뢰할 수 있는 방법입니다..

병원체 전파 연구

• SSCP는 병원체의 전파 경로를 연구하는 데 활용됩니다..

정량적 DNA 분석

• 유방암 세포 분석:
  • SSCP, 경쟁 PCR과 결합, 유방암 세포의 돌연변이 P53 유전자의 정량 분석에 사용되었습니다..
  • 이 방법의 장점은 Target DNA와 단 하나의 염기만 다른 내부 표준물질을 사용한다는 점입니다., 동일한 증폭 조건을 보장하여 보다 정확한 DNA 정량화.

SSCP에 대한 주의 사항

SSCP는 빠른, 단순한, 유전자 돌연변이를 검출하는 민감한 방법 및. 최적의 결과를 얻으려면, 다음 예방 조치를 준수해야합니다:

반복성:

• SSCP의 반복성에 영향을 미치는 주요 요인은 전기영동 전압과 온도입니다.. 이러한 조건을 일정하게 유지하면 SSCP 패턴의 우수한 반복성이 보장됩니다..
• 일반적으로, SSCP 패턴은 두 개의 단일 가닥 DNA 밴드를 보여줍니다., 그러나 때로는 두 개의 단일 가닥 DNA 분자 사이의 유사한 공간 구조로 인해 하나 또는 세 개 이상의 밴드가 나타날 수 있습니다.. 3개 이상의 밴드가 존재한다는 것은 야생형 DNA 단편과 돌연변이 DNA 단편이 혼합되어 있음을 의미할 수 있습니다..

표적 DNA 서열 길이의 영향:

• SSCP는 긴 것보다 짧은 DNA 또는 RNA 서열에서 점 돌연변이를 검출하는 데 더 효과적입니다.. 이는 더 긴 분자의 단일 염기 변화가 공간 구조 유지에 미치는 영향이 적기 때문일 수 있습니다..
• 일부 연구자들은 DNA 사슬이 다음보다 짧다고 믿습니다. 400 bp, 길이는 SSCP의 효율성에 영향을 미치지 않습니다.. 실험 조건을 신중하게 선택하면 이상의 검출률을 달성할 수 있습니다. 90% 점 돌연변이의 경우 354 bp DNA 단편.

전기영동 전압 및 온도:

• 단일 가닥 DNA의 안정적인 공간 형태를 유지하려면, SSCP는 더 낮은 온도에서 수행되어야 합니다. (일반적으로 4°C~15°C 사이). 시작 시 고전압 (250V) ~을 위한 5 몇 분이면 겔 온도를 크게 올리지 않고도 초기에 서로 다른 형태의 단일 가닥 DNA를 분리하는 데 도움이 됩니다.. 그 다음에는 전압을 낮추어야 합니다. (약 100V) 가닥을 더 분리하기 위해.
• 전기영동을 위한 정확한 전압은 특정 실험 조건에 따라 결정되어야 합니다..

점 돌연변이 위치의 영향:

• DNA 또는 RNA의 점 돌연변이 위치는 공간 형태를 유지하는 역할에 따라 SSCP 감지율에 영향을 미칩니다., 체인의 선형 위치보다는.
• DNA 중앙 영역의 돌연변이는 일반적으로 끝 근처의 돌연변이에 비해 감지하기가 더 쉽습니다..
• 하지만, 중앙 영역의 돌연변이라도 공간 구조를 크게 변경하지 않으면 감지되지 않을 수 있습니다.. 예를 들어, White의 연구는 다음과 같은 사실을 발견했습니다. 2 밖으로 9 헤어핀 구조의 루프에서 점 돌연변이가 있는 샘플이 검출되었습니다., 검출률을 나타내는 22%.

SSCP 결과 해석:

• SSCP는 분자량이나 전하보다는 공간 구조를 기반으로 단일 가닥 DNA를 분리합니다.. 때때로, 정상 사슬과 돌연변이 사슬의 이동 속도는 매우 비슷합니다., 그것들을 구별하기 어렵게 만든다.
• 일반적으로, 전기 영동 길이 16-18 cm는 검출 한계에 따라 결과를 정확하게 결정하는 데 필요합니다., 이는 돌연변이 DNA 단편과 정상 DNA 단편 사이에서 식별할 수 있는 가장 작은 전기영동 거리 차이입니다..
• 거리가 검출 한계보다 큰 경우 (예를 들어, 3mm), 돌연변이가 나타남. 거리가 작을수록 변화가 없음을 나타냅니다.. 낮은 검출 한계를 설정하면 오탐(false positive)이 발생할 수 있습니다..
• 기타 조건, PCR 산물의 로딩량 등, PAG 가교 정도, 및 겔 농도, 특정 실험 요구 사항에 따라 선택해야 합니다..

PCR-SSCP의 단계별 세부정보

샘플 준비

1. PCR 증폭 및 검출:
   • 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행하고 적절한 어닐링 온도를 선택합니다..
   • 증폭 산물을 실행하여 감지합니다. 2-2.5% 수평 전기영동을 통한 아가로스 젤. 짐 3-5 PCR 산물의 μl.
   • PCR 산물의 최적 농도는 약 10 ng/μl.
2. PCR 산물과 변성 완충액 혼합:
   • 추가하다 5 SSCP 샘플 버퍼의 μl (변성 완충액, 시퀀싱 버퍼와 동일 “분자 복제”) 깨끗한 PCR 튜브 바닥에.
   • PCR 증폭산물을 버퍼 중앙에 첨가합니다.. 아가로스겔에 밴드가 보이는 정도에 따라 양을 조절하세요.:
     • 밴드가 밝다면, 추가하다 1 μl.
     • 결과가 훌륭하다면, 추가하다 0.5 μl.
     • 밴드가 매우 명확하지 않은 경우, 추가하다 1.5, 2, 또는 3 그에 따라 µl.
   • 샘플 버퍼의 양을 비례적으로 늘리십시오., 예를 들어, ~을 위한 3 PCR 생성물의 μl, 추가하다 8 더 나은 변성을 위한 완충액 µl.
3. PCR 산물의 변성:
   • 튜브를 원심분리하여 시료를 바닥에 농축합니다..
   • 샘플을 95°C에서 변성시킵니다. 10 분을 사용하여 PCR 기계, 그런 다음 즉시 PCR 산물을 얼음 위에 올려 놓습니다. 5 재생을 방지하는 데 몇 분.

   메모: 단계 3 그리고 4 젤 준비 4단계 이후 젤이 굳을 때까지 기다리는 동안 수행할 수 있습니다..

젤 준비

1. 유리판 준비:
   • 각 유리판 쌍을 수돗물로 헹구고 ddH2O로 헹구세요..
   • 흡수지로 유리판을 말린 후 무수 에탄올로 닦아냅니다..
   • 에탄올을 증발시키십시오. 2-3 분.
   • 유리판을 조립하여 젤 캐스팅 스탠드에 넣습니다., 양쪽 측면과 바닥이 안전하게 고정되었는지 확인.
   • 플레이트의 수평을 유지하기 위해 조립 나사를 조입니다.. (무수 에탄올을 사용하여 누출 여부를 확인하십시오.)

대형 젤 (50% 글리세롤 농도)

작은 젤 (50% 글리세롤 농도)

젤 푸어링

1. 젤 혼합: 제공된 제형에 따라 겔 용액을 제조한 후, 균일하게 되도록 잘 섞어주세요.
2. 유리판에 붓기: 준비된 젤 용액을 조립된 유리판에 조심스럽게 붓습니다.. 붓는 과정에서 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오.. 기포가 관찰되는 경우, 기포가 표면으로 올라갈 수 있도록 접시를 살짝 기울입니다.. 플레이트의 측면을 가볍게 두드리면 갇힌 기포를 방출하는 데 도움이 될 수 있습니다..
3. 빗 삽입: 겔 용액 수준이 유리판 상단 가장자리 아래 약 0.5cm에 도달하면, 빗을 젤에 삽입하세요. 빗살과 젤 표면 사이에 기포가 끼어 있지 않은지 확인하십시오.. 기포가 있는 경우, 빗을 제거하다, 거품을 풀어주세요, 빗을 조심스럽게 다시 삽입하세요..
4. 겔 중합 허용: 빗을 꽂은 후, 플레이트를 평평하게 또는 약간의 각도로 배치하여 젤이 중합되도록 하십시오. (미만 10 도) 대략적으로 평평한 표면에 30 분. 이 기간 동안, 젤이 중합되어 굳어집니다..

메모: 이는 또한 단계에 설명된 대로 PCR 샘플의 변성을 진행하기에 적합한 시간입니다. 3 그리고 4 첫 번째 섹션의.

젤 로딩

• 젤 배치:
  • 중합 후 즉시 젤에서 빗을 제거합니다..
  • 유정의 무결성을 유지하기 위해 균일한 힘이 가해지는지 확인하세요..
  • 웰 쪽이 안쪽을 향하도록 하여 겔 플레이트를 전기 영동 장치에 고정합니다..
  • 큰 기포를 피하기 위해 젤 플레이트를 전기 영동 완충액으로 천천히 전환하십시오..
• 사전 전기영동:
  • 액체 레벨이 유리판의 짧은 가장자리보다 약 1cm 위에 올 때까지 상부 저장소에 1× TBE 전기영동 완충액을 추가합니다..
  • 상부 저장소에서 누출이 없는지 확인하십시오..
  • 대형 기기는 140~150V, 소형 기기는 110~120V로 전압을 설정하세요..
  • 약 사전 전기 영동 10 분.
• 샘플 로딩:
  • 마이크로 주사기를 사용하여 준비된 샘플을 젤의 웰에 순차적으로 추가합니다..
  • 각 젤 플레이트의 가장자리에 가장 가까운 두 개의 웰에 샘플을 로드하지 마십시오..
• 전기영동:
  • 대형 기기는 140~150V, 소형 기기는 110~120V로 전압을 설정하세요..
  • 최소 10~15°C의 온도에서 전기영동을 수행합니다. 10 시간.

더럽히는 것

• 정착:
  • 장치에서 젤을 제거하십시오, 출발점을 표시하다, 그리고 담그세요. 70% 에탄올 15 셰이커에 몇 분.
  • 고정 후 에탄올을 회수하고 증류수로 약 2회 헹구어 줍니다. 3 헹굼당 분.
• 더럽히는 것:
  • 염색 용액에 젤을 염색합니다. (200ml 함유 3.6% NaOH 4.2ml, 20% AgNO3 3.6ml, 암모니아 2ml) ~을 위한 30 분.
  • 두 개의 젤을 동시에 염색하는 경우 염색 시간을 조정하세요..
• 개발 중:
  • 현상액에서 젤을 현상합니다. (200ml 함유 1% 구연산나트륨 1ml, 포름알데히드 100ul) 밴드가 선명하게 보일 때까지.
  • 증류수로 세 번 헹궈주세요. 3 개발을 중단하기 위해 분마다.
  • 대안으로, 0.5ug/ml 에티듐 브로마이드가 함유된 1x TBE 완충액에 겔을 담가 염색합니다. 10 분 동안 자외선 아래에서 시각화

방식

10×TBE 공식:

• 트리스 베이스: 108g
• 붕산: 55g
• 0.5몰/L EDTA (pH 8.0), 용량을 1L로 조정했습니다.

변성 완충제 공식:

• 98% 탈이온화된 포름아미드
• 10mmol/L EDTA (pH 8.0)
• 0.025% 자일렌 시아놀 FF
• 0.025% 브로모페놀블루

노트:

1. 재현성:
   • 전기영동 시 안정적인 전압과 온도를 유지하는 것이 SSCP의 재현성에 영향을 미치는 주요 요소입니다..
   • 일반적으로, SSCP 패턴은 두 개의 단일 가닥 DNA 밴드를 보여줍니다., 그러나 때로는 하나 또는 세 개 이상의 밴드만 나타날 수도 있습니다., 아마도 야생형 DNA 단편과 돌연변이 DNA 단편 사이에 유사한 3차원 구조가 존재하기 때문일 수 있습니다..
2. 표적 DNA 서열 길이의 영향:
   • SSCP는 긴 사슬 DNA에 비해 짧은 사슬 DNA 또는 RNA의 점 돌연변이에 대한 검출률이 더 높습니다.. 이는 장쇄 DNA 및 RNA 분자의 개별 염기 변화가 3차원 구조를 유지하는 데 더 작은 영향을 미치기 때문인 것 같습니다..
   • DNA 사슬이 짧은 경우 (400bp 이하), DNA의 길이는 SSCP의 효율성에 영향을 미치지 않습니다..
3. 전기영동 전압 및 온도의 영향:
   • 단일 가닥 DNA의 안정적인 3차원 형태를 유지하기 위해, SSCP는 더 낮은 온도에서 수행되어야 합니다. (일반적으로 4°C~15°C 사이).
   • 전기영동 중, 과도한 전압으로 인해 온도가 상승할 수 있습니다.. 그러므로, 냉각장치가 없는 전기영동조에서 SSCP를 수행할 때, 더 높은 전압 (250V) 처음에 사용해야합니다, 전기영동을 위해 약 100V로 감소.
4. SSCP 결과의 해석:
   • SSCP 분석에서, 단일 가닥 DNA 단편의 분리는 분자량보다는 입체 장애의 크기에 기초합니다., 따라서 분자량을 반영할 수 없습니다..
   • 결과 해석은 검출 한계를 기반으로 해야 합니다., 이는 돌연변이 DNA 단편과 정상 DNA 단편을 구별할 수 있는 전기영동 거리의 최소 차이를 의미합니다..
5. 기타 고려 사항:
   • PCR 산물의 로딩량 등의 조건, 폴리아크릴아미드 겔의 가교 밀도, 특정 실험 조건에 따라 겔의 농도를 선택하고 결정해야 합니다..