현장 PCR이란 무엇입니까?? 무엇을 위해 사용됩니까??

현장 PCR, 또는 현장 중합효소 연쇄 반응, 과학 연구에 사용되는 기술이다. 과학에서 개발 된 각 새로운 기술은 일련의 새로운 연구 결과를 제공합니다., 따라서 다양한 분야의 발전을 주도합니다.

현장 PCR의 개발

• 1950 년대, 형태 학적 관찰에 전자 현미경의 도입은 세포 수준에서 세포질 수준까지 심층적 인 연구를 가져 왔습니다..
• 1960 년대와 1970 년대, 면역 조직 화학 및 면역 세포 화학 기술의 광범위한 적용은 세포 내 구조에서 단백질 분자 수준으로 관찰을 밀어 냈다., 세포 내 또는 세포 내 수준에서 수많은 활성 물질의 국소화를 허용, 의료 생물학의 개발에 큰 영향을 미칩니다.
• 1970 년대, 형태에서 분자 생물학 기술의 광범위한 적용, 현장 하이브리드 화 기술의 출현과 함께, 조직 세포 내에서 특정 DNA 또는 RNA 서열의 국소화를 가능하게, 단백질에서 유전자 수준으로 관찰 및 국소화 수준을 높이기, 즉 핵산 분자. 이것은 유전자 수준에서 많은 생물학적 현상에 대한 인간의 이해가 깊어졌습니다..
• 1980 년대, PCR (폴리 메라 제 연쇠 반응), 분자 생물학 분야의 강력하고 중요한 기술, 등장했다. 그것은 형태 학적 관찰 분야에 빠르게 소개되었습니다., 낮은 카피 번호 또는 세포 내 단일 사본을 갖는 특정 DNA 또는 RNA의 국소화 및 관찰 가능. 이 기술의 출현은 더 많은 연구 결과를 제시해야합니다., 중요한 걸음으로 형태 학적 연구를 추진합니다.

현장 PCR의 원리

• 기본 원리: 현장 PCR은 PCR의 고효율 증폭과 조직 내 하이브리드 화의 세포 위치를 결합하여 조직 세포 내에서 특정 DNA 또는 RNA 서열을 검출합니다..
• PCR 기술: DNA 폴리머 라제를 사용하여 변성을 통해 특정 표적 서열을 증폭시킵니다., 가열 냉각, 및 확장주기, 매우 민감하고 특정한 증폭을 초래합니다.
• 전통적인 PCR의 한계: 전통적인 PCR은 액체상에서 수행됩니다, 증폭 전에 세포 파괴 및 핵산 추출이 필요합니다, PCR 결과를 세포 형태와 상관시키고 특정 표적 서열을 포함하는 세포 유형을 식별하는 데 어려움.
• 현장 PCR의 장점: 각각의 한계를 극복하면서 PCR과 현장 하이브리드 화 기술의 강점을 결합합니다..
• 절차: 조직 샘플은 세포 형태를 유지하기 위해 화학적으로 고정된다. 세포 및 핵막의 투과성은 PCR 성분이 세포 또는 핵으로 들어갈 수 있도록합니다., 여기서 그들은 현장에서 고정 된 RNA 또는 DNA를 증폭시킨다. 증폭 된 제품, 일반적으로 큰 분자 또는 짜여진 구조, 현장에서 유지되고 현장 혼성화에 의해 쉽게 감지됩니다..
• 이익: 세포 내에서 특정 DNA 또는 RNA 서열의 지수 증폭을 가능하게합니다., 현장 하이브리드 화를 통해 탐지를 용이하게합니다.

기본 유형 현장 PCR

현장 PCR 기술은 두 가지 주요 유형으로 분류 할 수 있습니다.: 직접 방법 및 간접 방법, 트리 포스페이트 뉴클레오티드 또는 증폭 반응에 사용 된 프라이머가 표지되어 있는지에 기초하여. 추가적으로, 역전사 in-situ PCR 기술이 있습니다.

직접 방법 인시 투스 PCR 기술:

• 직접 방법으로, 증폭 생성물은 마커 분자로 직접 표지됩니다, 표지 된 트리 포스페이트 아데노신 또는 프라이머 단편과 같은. 시편의 PCR 증폭 동안, 표지 된 분자는 증폭 된 생성물에 통합된다, 시편에서 특정 DNA 또는 RNA의 시각화 활성화 (현장).
• 일반적인 마커에는 35S와 같은 방사성 동위 원소가 포함됩니다, 비오틴, 및 디 록시 게닌. 이 마커’ 위치는 방사성 동위 원소 또는 친 화성 조직 화학 및 비오틴 및 디 옥시 게닌에 대한 면역 조직 화학과 같은 방법을 사용하여 검출 될 수 있습니다..
• 직접 방법의 장점에는 단순성이 포함됩니다, 처리 시간이 짧습니다, 그리고 작동의 용이성. 하지만, 특이성이 낮은 것과 같은 단점이 있습니다, 잘못된 긍정적 인 가능성이 높다, 및 낮은 증폭 효율, 특히 단면 중 DNA 손상이 잘못된 양성으로 이어질 수있는 파라핀 섹션에서.
• 간접적 인 방법 In-Situ PCR 기술:

간접적 인 방법 In-Situ PCR 기술:

• 간접 방법에서, 특정 DNA 또는 RNA 증폭은 세포 내에서 처음 수행됩니다., 라벨이 붙은 프로브를 사용하여 현장 혼성화, 특이성을 크게 향상시킵니다. 현재 가장 널리 사용되는 현장 PCR 기술입니다..
• 직접 방법과 달리, 반응 시스템은 기존 PCR과 유사하다, 표지 된 프라이머 또는 트리 포스페이트 아데노신 사용. 목적은 먼저 증폭시키는 것입니다, 그런 다음 현장 하이브리드 화 기술을 사용하여 세포 내에서 증폭 된 특정 DNA 제품을 감지합니다.. PCR과 현장 혼성화 기술을 효과적으로 결합합니다, PCR 인시 투 하이브리드 화로도 알려져 있습니다 (타자).
• 간접 방법의 장점은 더 높은 특이성 및 증폭 효율을 포함합니다., 그러나 직접 방법보다 더 복잡한 작동 단계가 포함됩니다..

현장 역전사 PCR 기술:

• 현장 역전사 PCR (현장 RT-PCR) 액체상 RT-PCR 기술을 조직 세포 샘플에 적용하는 새로운 기술입니다.. 액체상 RT-PCR과 달리, 조직 샘플은 조직 내 역전사 PCR 전에 DNA 효소로 처리되어 조직 DNA를 파괴합니다., 증폭 된 템플릿이 cDNA가 mRNA로부터 합성되도록 보장, 세포의 원래 DNA가 아닙니다. 다른 기본 단계는 액체 상자 RT-PCR과 유사합니다.

현장 PCR 테스트를 실행하는 방법?

In-Situ PCR 기술의 기본 단계에는 샘플 준비가 포함됩니다., 현장 증폭 (PCR), 그리고 현장 탐지, 아래에 요약 된대로 (파라핀 섹션에 중점을 둡니다):

샘플 준비:

• 현장 PCR 기술은 세포 현탁액에 적용될 수있다, 세포 얼룩, 냉동 섹션, 및 파라핀 섹션.
• 다른 방법에 비해, 현장 PCR은 중단 된 온전한 세포로 최상의 결과를 산출합니다., 파라핀 섹션은 가장 열악한 결과를 산출합니다.
• 성능 저하의 이유는 다음과 같습니다:
  • 슬라이드에서 PCR을 수행 할 때 열전도율이 좋지 않음 및 고르지 않은 열 대류.
  • 유리 슬라이드에 대한 TAQ DNA 효소 흡착.
  • 샘플 처리 후, 세포에는 손상되지 않은 세포질 또는 핵막이 부족합니다, 증폭 생성물의 확산과 현장에서이를 유지하는 데 어려움.
• 대부분의 병리 표본은 포르말린으로 고정되어 파라핀에서 보존됩니다..
• 파라핀 섹션에서 현장 PCR과 관련된 기술적 문제를 해결하는 것은 매우 중요합니다..

조직 세포 고정: 조직 세포는 일반적으로 고정됩니다 10% 완충 포르말린 또는 4% 더 나은 시동 PCR에서 더 나은 결과를 얻기위한 파라 포름 알데히드. 고정 시간이 지나치게 길어서는 안됩니다, 일반적으로 4-6 4 ° C에서 시간.

슬라이스 두께: 두꺼운 슬라이스는 일반적으로 더 많은 표적 DNA 및 막 구조를 포함하기 때문에 현장 PCR에서 더 나은 결과를 산출합니다., 증폭 생성물의 확산 방지. 하지만, 두꺼운 슬라이스는 형태 학적 관찰에서 더 많은 세포 겹치고 해상도를 감소시킬 수 있습니다..

슬라이드 처리: PCR 및 현장 혼성화 동안 파라핀 섹션의 분리를 방지하기 위해, 분리를 방지하기 위해 슬라이드를 처리해야합니다. 일반적인 방법에는 폴리 -L- 리신으로 코팅 또는 실라 니화 처리가 포함됩니다, 일반적으로 조직 분리를 방지합니다.

프로테아제 소화:

현장 증폭 (PCR): 현장 증폭은 조직 세포 표본에서 PCR 반응을 수행하는 것과 관련이 있습니다., 기본 원리는 액체 상 PCR과 동일합니다.. PCR에 사용되는 프라이머는 일반적으로 15-30bp입니다, 증폭 된 단편은 약 100-1000bp입니다.

반응 시스템:

• 현장 PCR에 대한 반응 시스템은 기존 액체 PCR의 반응 시스템과 유사합니다..
• 더 높은 농도의 프라이머, TaqDNA 폴리머 라제, 및 액체 상 PCR 시스템에 비해 고정 된 조직 슬라이스에서 더 나은 증폭 결과를 위해 MG2+가 제안된다..
• 소 혈청 알부민 (BSA) TAQ DNA 폴리머 라제가 유리 슬라이드에 결합하는 것을 방지하고 증폭 효율을 감소시키기 위해 반응 시스템에 추가해야합니다..

열 순환:

• 현장 PCR의 열 사이클링은 특수 열 사이클러 또는 일반 PCR 열 사이클러에서 수행 할 수 있습니다..
• 현장 PCR의 열 사이클링의 각 단계는 기존의 PCR보다 약간 길을 수 있도록 적절한 증폭을 보장합니다..
• 열 사이클링 동안 반응 시스템의 손실을 최소화하기 위해 핫 스타트 방법을 사용 할 수 있습니다..

세탁:

• 현장 증폭 후, 샘플은 외부 세포를 확산시킨 증폭 생성물을 제거하기 위해 세척을 겪어야합니다..
• 부적절한 세척은 탐지 중 증폭 제품의 시각화로 이어질 수 있습니다., 과도하게 어두운 배경 또는 잘못된 양성 결과를 초래합니다.
• 과도한 세척은 또한 세포 내부에서 증폭 된 생성물을 제거 할 수 있습니다., 양성 신호 약화 또는 손실.

고정 후: 일부 저자는 사용을보고했습니다 4% 파라 포름 알데히드 2 시간 또는 2% 글루 타르 알데히드 5 증폭 후 고정 후 분의 분은 증폭 된 생성물이 검출 동안 세포에 잘 유지되도록합니다., 따라서 감지의 감도와 특이성을 향상시킵니다.

현장 탐지: 현장 PCR의 증폭 생성물을 검출하는 방법은 현장 PCR 프로토콜의 설계에 달려 있습니다.. 직접 방법은 표지 된 분자의 특성에 따라 증폭 된 생성물을 직접 감지합니다., 간접적 인 방법은 현장 하이브리드 화를 통해 탐지가 필요합니다.

현장 PCR의 적용

외인성 유전자의 검출

• 바이러스 유전자의 검출:
  • 바이러스에 감염된 세포에서, 탐지는 어려울 수 있습니다. 하지만, 현장 PCR은 이러한 어려움을 해결하기위한 희망을 제공합니다.
  • SITU PCR은 HIV와 같은 다양한 바이러스의 역할을 관찰하기 위해 성공적으로 적용되었습니다., HPV, HSV, HBV, HCV, 등., 에이즈와 같은 조건에서, 생식계 종양, 간염, 간암, 감염된 개인의 적시 식별을 가능하게합니다.
• 박테리아 유전자의 검출:
  • Mycobacterium tuberculosis의 저명한 응용 프로그램이 있습니다.. 결핵 병변이 비정형 일 때, 특수 염색 방법을 사용하여 현미경에서 박테리아를 식별하는 것은 어렵습니다.. 현장 PCR은 결정적인 진단을 도울 수 있습니다, Mycobacterium 결핵의 존재가 최소화 되더라도.
• 수입 유전자의 검출:
  • 형질 전환 동물에 대한 연구에서, 유전자 수입 확인, 유전자 요법을받는 환자뿐만 아니라, 현장 PCR을 사용하여 확인할 수 있습니다. 따라서, 현장 PCR은 중요한 탐지 방법이되었습니다.

내인성 유전자의 검출

비정상 유전자의 검출:

• 돌연변이 및 재 배열 검출:
  • 현장 PCR은 신체 내 유전자에서 돌연변이 및 재 배열을 감지 할 수 있습니다..
  • 프로토-온 코겐 및 종양 억제제 유전자의 돌연변이, 면역 글로불린 중쇄 유전자의 재 배열, 현장 내 PCR을 사용하여 검출 된 유전 적 변화의 예이다.
• 암 연구 및 진단 응용:
  • 이러한 돌연변이 및 재 배열은 암 발달 및 진행에서 중요한 역할을합니다..
  • 현장 PCR은 이러한 유전 적 변화의 정확한 탐지를 가능하게하여 암 연구 및 진단에 광범위한 응용을 제공합니다..
  • 그것은 암의 기초가되는 분자 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고 표적 요법의 발달에 도움이됩니다..

구성 유전자의 검출:

• 저수준 유전자 발현의 도전:
  • 낮은 수준에서 발현 된 구성 유전자는 탐지 방법에 대한 도전에 도전합니다..
  • 신체 세포의 제한된 유전자 카피 수로 인해 현장 혼성화 기술은 비효율적입니다..
• 액체상 PCR의 한계:
  • 액체 상 PCR은 저수준 유전자를 증폭시키고 탐지 할 수 있지만 세포 유형 특이성이 부족합니다..
  • 그것은 어떤 세포 유형이 목표 유전자를 정확하게 포함하는지 결정할 수 없습니다..
• 현장 PCR의 장점:
  • 현장 PCR은 이러한 한계를 극복합니다.
  • 그것은 다양한 인간 유전자의 검출을 가능하게합니다, 낮은 수준으로 표현 된 사람들조차도.
  • 현장 PCR은 특정 세포 유형 내에서 정확한 유전자 위치를 제공함으로써 인간 유전자 맵의 완료에 기여합니다..