폴리 메라 제 연쇠 반응 (PCR) 분자 생물학 연구 및 진단에 혁명을 일으켰습니다. 이 다재다능한 기술을 사용하면 단 몇 시간 만에 표적 DNA 서열을 기하급수적으로 증폭할 수 있습니다.. 하지만 PCR이 작동했는지 어떻게 알 수 있나요?? 그리고 예상했던 제품을 생성했다면, 정확한 크기를 어떻게 알 수 있나요?? 이것이 바로 DNA 사다리가 등장하는 곳이다.
DNA 사다리 란 무엇입니까??
DNA 사다리에는 알려진 DNA 조각이 들어 있습니다., 특정 크기. 인치나 센티미터 단위로 표시가 있는 눈금자와 같습니다., DNA 사다리는 겔 전기영동을 실행할 때 크기 기준 역할을 합니다.. PCR 샘플 밴드를 사다리 조각과 비교하여, 알려지지 않은 DNA 조각의 크기를 추정할 수 있습니다..
DNA 사다리는 다음과 같은 DNA 분자로 구성됩니다. 100 염기쌍 이상 10,000 기본 쌍. 조각은 종종 배수입니다. 100 또는 1,000 기본 쌍. 간격이 있는 사다리 100 bp는 작은 PCR 산물의 크기를 결정하는 데 가장 적합합니다., ~하는 동안 1 kb 래더는 더 큰 앰플리콘에 더 잘 작동합니다..
DNA 사다리는 어떻게 만들어지나요??
기성품 사다리를 구입할 수 있지만, 실험실에서 DNA 사다리를 만들 수도 있습니다. 다음은 몇 가지 일반적인 준비 방법입니다.:
- 제한효소 소화 플라스미드 DNA– 플라스미드는 HindIII 또는 EcoRI와 같은 효소로 절단되어 특정 크기의 단편을 분리합니다..
- PCR에 의한 증폭– 다양한 길이의 표적 서열이 개별적으로 증폭된 후 래더로 결합됩니다..
- 연쇄체의 부분 소화– DNA 서열의 직렬 반복이 절단되어 다량체를 생성함.
- 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화– 짧은 단일 가닥 DNA 단편은 이중 가닥 다중체로 어닐링됩니다..
제작방식에 상관없이, 핵심은 원하는 크기 범위를 포괄하는 개별 밴드 세트를 생성하는 것입니다..
DNA 사다리는 어떻게 사용됩니까??
이제 DNA 사다리가 무엇인지 이해하셨으니, 어떻게 사용되나요?? DNA 사다리는 두 가지 필수 목적을 제공합니다.:
1. 크기 추정
아가로스 또는 폴리아크릴아미드 젤에서 PCR 샘플과 함께 DNA 사다리를 실행하여, 알려지지 않은 DNA 조각의 크기를 추정할 수 있습니다..
전기영동 중, 사다리와 시료는 크기에 따른 속도로 겔 매트릭스를 통해 이동합니다.. 작은 조각은 젤 아래로 더 멀리 이동합니다., 큰 조각은 지연되는 동안.
DNA를 염색하여 시각화하면, 사다리 조각이 날카롭게 보입니다., 개별 밴드. 샘플 밴드를 일치하는 크기의 래더 밴드로 정렬하여, PCR 산물의 대략적인 길이를 확인할 수 있습니다..
2. 품질 관리
DNA 사다리의 포함은 PCR 증폭이 작동했음을 시각적으로 제어하는 역할도 합니다.. 사다리를 기준으로 예상되는 위치에서 이동하는 뚜렷한 샘플 밴드를 관찰할 때, 이는 PCR이 성공했다는 빠른 확인을 제공합니다..
밴드가 하나도 보이지 않으면, 사다리는 전기영동 자체가 제대로 수행되었음을 나타냅니다.. 이는 PCR 반응이 실패했을 수 있으며 문제 해결이 필요함을 나타냅니다..
어떤 크기의 DNA 사다리를 사용해야 합니까??
다양한 DNA 사다리 이용 가능, 실험에 적합한 것을 어떻게 선택합니까?? 고려해야 할 주요 요소는 다음과 같습니다.:
- 크기 범위– 사다리 범위는 예상되는 PCR 제품 크기를 포함해야 합니다.. 앰플리콘의 경우 1 kb, ㅏ 100 bp 또는 1 kb사다리가 적당해요. 더 큰 제품의 경우, 다음과 같은 더 높은 사다리를 선택하십시오 5 kb 또는 10 kb.
- 밴드 간격– 주어진 크기 범위에서 더 많은 기준 밴드를 갖춘 사다리를 사용하면 크기 조정 정밀도가 더 높아집니다.. 하지만, 밀접하게 간격을 둔 밴드는 완전히 해결하는 데 더 오랜 시간이 걸립니다.. 시간이 제한되어 있거나 대략적인 크기만 필요한 경우, 조각이 적은 사다리를 사용하십시오.
- 즉시 로드 가능– 미리 만들어진, 즉시 로드 가능한 사다리는 정확한 밴드 강도를 보장합니다.. 사다리를 직접 희석하거나 혼합하지 마십시오..
- 샘플 번호– 여러 샘플의 경우, 나란히 비교할 수 있도록 더 큰 사다리 차선 크기를 선택하십시오..
- 예산 – 대량의 젤을 생산하는 경우 비용을 고려하십시오.. 일부 사다리는 더 경제적입니다..
DNA 사다리를 읽는 방법?
전기영동 후 젤이 시각화되면, PCR 제품 크기를 결정하기 위해 사다리를 어떻게 읽습니까?? 다음 단계를 따르세요:
- DNA 사다리 조각이 포함된 차선 식별. 이는 일반적으로 첫 번째 및/또는 마지막 레인에 로드됩니다..
- 사다리 제조업체의 참조 차트를 기준으로 염기쌍 DNA 밴드의 크기를 확인하세요.. 사다리는 쉽게 읽을 수 있도록 색상으로 구분되어 있습니다..
- 알려지지 않은 샘플 밴드를 래더와 비교, 사다리 차선에서 가장 가까운 밴드 식별. 밴드의 크기는 해당 사다리 조각과 비슷합니다..
- 더 높은 정밀도를 위해, 두 래더 조각 사이의 밴드 크기 보간. 예를 들어, 밴드가 500 그리고 600 bp 사다리 밴드, 그 크기를 다음과 같이 추정한다 550 bp.
- 크기 정확도를 높이려면, 래더 밴드 사이의 분리를 최대화하려면 젤을 더 오래 실행하십시오.. 더 적은 양의 래더를 로드하면 밴드 해상도도 향상될 수 있습니다..
일반적으로 사용되는 DNA 사다리의 예는 무엇입니까??
New England Biolabs와 같은 제조업체에서 다양한 유형의 DNA 사다리를 구입할 수 있습니다., 써모피셔, 그리고 인비트로젠. 일반적으로 사용되는 일부 옵션은 다음과 같습니다.:
- 100 bp DNA 사다리 – 포함 12 조각들 100 bp to 1,500 bp. 다음 PCR 제품에 이상적입니다. 1,000 bp.
- 1 kb DNA 사다리– 구성됨 13 밴드 250 bp to 10,000 bp. 최대 앰플리콘에 적합 10 kb.
- 1 kb 플러스 DNA 사다리– 확장 버전 1 추가 고분자량 및 저분자량 단편이 포함된 kb 사다리.
- FastDigest DNA 사다리– 젤에 직접 로딩할 수 있는 사전 소화된 사다리. 더 적은 수의 밴드로 빠른 실행 시간 가능.
- 고분자량 DNA 사다리 – 더 큰 DNA 조각을 포함합니다. 48,500 고분자량 게놈 DNA의 크기를 결정하기 위한 bp.
DNA 사다리를 준비하고 로드하는 방법?
DNA 사다리의 모든 이점을 활용하려면, 적절한 준비 및 로딩 기술이 핵심입니다:
- 사용하기 전에 사다리의 무결성을 확인하십시오 – 밴드 번짐이나 품질 저하가 있는지 검사하세요..
- 부드럽게 섞어주세요 – DNA 전단을 방지하기 위해 격렬한 소용돌이를 피하십시오..
- 제조사 권장량을 사용하세요 – Underloading은 약한 밴드 강도를 제공합니다.. 과부하로 인해 포화가 발생합니다..
- 첫 번째 및/또는 마지막 차선에 사다리를 싣습니다. – 샘플 양면에 크기 참조를 제공합니다..
- 사다리가 없는 차선 포함 – 오염 제어 역할을 합니다..
이러한 모범 사례를 따르면 매번 최적의 래더 성능을 얻을 수 있습니다..
DNA 사다리를 만드는 방법?
미리 만들어진 사다리를 구입하는 것이 가장 쉬운 방법이지만, PCR과 제한효소 분해를 이용해 DNA 사다리를 만들 수도 있습니다.. 다음은 프로세스 개요입니다.:
- 다양한 길이의 특정 표적 서열을 증폭하기 위한 PCR 프라이머 디자인, ~와 같은 500, 750, 1,000, 그리고 1,500 bp.
- 각 프라이머 쌍을 사용하여 개별 PCR을 실행하여 정의된 크기의 DNA 단편을 생성합니다..
- PCR 산물을 정제하고 각 단편의 DNA 농도를 정량화합니다..
- 동일한 제한 효소로 조각을 소화하여 호환 가능한 끈적끈적한 말단을 생성합니다..
- 원하는 밴드 강도를 달성하기 위해 특정 몰비로 조각을 혼합합니다..
- 단편을 결찰하여 제한 부위로 분리된 다량체를 형성합니다..
- 범용 프라이머를 사용하여 증폭하여 연쇄체 생성.
- 내부 부위를 절단하기 위해 원래의 제한 효소로 연쇄체를 부분적으로 소화합니다..
- 소화물을 정제하고 혼합하여 최종 DNA 사다리에 넣습니다..
DNA 사다리가 PCR에 중요한 이유?
DNA 사다리는 중합효소 연쇄반응에 필수적입니다 (PCR) 몇 가지 주요 이유로 애플리케이션:
정확성과 재현성
DNA 사다리를 사용하면 정확한 크기 조정과 PCR 결과의 일관된 재현성을 얻을 수 있습니다.. 밴드를 사다리의 분자량 표준과 비교함으로써, 앰플리콘 크기를 정확하게 결정하고 성공적인 타겟 증폭을 확인할 수 있습니다.. 이를 통해 여러 사용자 간에 결과를 안정적으로 재현할 수 있습니다., 장비, 그리고 실험실.
표준화
DNA 사다리를 포함하면 여러 PCR 샘플 간의 비교가 표준화됩니다.. 하나의 샘플의 다양한 조건을 분석하든, 아니면 수많은 환자 검체를 스크리닝하든 상관없습니다., 사다리는 결과를 평가하기 위한 지속적인 참조를 제공합니다.. 연구 및 임상 진단의 일관성을 위해서는 표준화가 중요합니다..
최적화
사다리는 증폭이 예상대로 발생하는지 표시하여 PCR 최적화를 용이하게 합니다.. 예상치 못한 밴드 크기 또는 약한 강도로 인해 최적이 아닌 조건이 드러남. 사다리는 최고의 프라이머를 도출하기 위한 문제 해결 프로토콜을 지원합니다., 사이클링 조건, 샘플 순도.
감광도
넓은 범위의 사다리로, 희미한 PCR 밴드도 시각화하고 크기를 조정할 수 있습니다.. 이를 통해 바이러스 부하 모니터링과 같은 애플리케이션에 중요한 낮은 템플릿 복사본을 감지할 수 있습니다.. 사다리가 제공하는 감도는 단일 분자 검출에서 PCR의 사용을 지원합니다..
멀티플렉싱
여러 프라이머 세트를 사용한 다중 PCR의 경우, 사다리는 각 대상 밴드의 신원을 확인합니다.. 이를 통해 한 번의 반응으로 여러 서열을 효율적으로 증폭할 수 있습니다..
오토메이션
DNA 사다리를 사용하면 PCR 젤의 자동 소프트웨어 분석이 가능합니다.. 컴퓨터 알고리즘은 사다리를 사용하여 젤 간의 밴드 이동 차이를 표준화합니다.. 이는 높은 처리량을 가능하게 합니다., 대규모 샘플 수의 신속한 분석.
요컨대, DNA 사다리로 PCR의 정확도 향상, 재현성, 표준화, 최적화, 감광도, 다중화 기능, 자동화. 새로운 프로토콜을 완성하든, 임상 샘플을 분석하든, 이 필수 도구는 귀하의 성공을 증폭시키고 우수한 연구 결과를 지원합니다.
