PCR 기술 개발
- 폴리 메라 제 연쇠 반응 (PCR) 특정 DNA 단편을 증폭시키는 데 사용되는 분자 생물학 기술입니다..
- 살아있는 유기체 밖에서 발생하는 특별한 유형의 DNA 복제로 간주 될 수 있습니다..
- DNA 폴리머 라제 I은 처음 발견되었습니다 1955.
- e. 사상, 1970 년대 초 Dr.. 시간. 클레 노우, 실험적 가치와 실용성이 있습니다.
- 하지만, 이 효소는 열 내성이 아니며 고온에서 거부, 고온 변성이 필요한 PCR에 사용하기에 부적합하게.
- 오늘날 일반적으로 사용되는 효소, 로 언급됩니다 Taq 중합효소, 박테리아 Thermus aquaticus에서 분리되었습니다 1976.
- 내선의 특징은 이상적인 효소입니다., 그러나 그 광범위한 사용은 1980 년대 이후에 이루어졌습니다.
- PCR의 원래 개념, 유전자 복구 복제와 유사합니다, 박사가 제안했습니다. Kjell Kleppe 1971.
- 그는 순수하고 일시적인 유전자 복제의 첫 번째 실험을 발표했습니다. (PCR의 처음 두 사이클과 유사합니다).
- 오늘 개발 된 PCR은 DR에 의해 개척되었습니다. 카리 b. mulles 1983, Mullis가 회사 PE에서 근무했을 때, PCR 분야에서 회사에 특별한 위치를 제공.
- Mullis와 Saiki는 공식적으로 첫 번째 관련 논문을 출판했습니다. 1985.
- 그 이후로, PCR의 적용은 빠르게 확장되었습니다, 관련 논문의 품질은 다른 많은 연구 방법을 능가했습니다..
- 그후, PCR 기술은 생물학적 연구 및 임상 응용 분야에서 널리 사용되었습니다., 분자 생물학 연구에서 중요한 기술이되고 있습니다.
- Mullis는 노벨 화학 상을 수상했습니다 1993 그의 기여를 위해.
PCR의 원리
PCR 기술의 기본 원리는 DNA의 자연 복제 과정과 유사합니다., 그리고 그것의 특이성은 양쪽 끝에서 표적 서열에 상보적인 올리고 뉴클레오티드 프라이머에 달려있다.. PCR은 세 가지 기본 반응 단계로 구성됩니다: 변성, 가열 냉각, 그리고 확장:
- 주형 DNA의 변성: 템플릿 DNA를 일정 시간 동안 약 93 ℃로 가열 한 후, 주형 DNA의 이중 가닥 DNA 또는 PCR 증폭에 의해 형성된 이중 가닥 DNA는 해리된다., 프라이머에 결합하고 다음 반응을 준비 할 수 있도록 단일 가닥으로 만들기.
- 가열 냉각 (재확인) 주형 DNA 및 프라이머의: 주형 후 DNA는 단일 가닥으로 변성된다, 온도는 약 55 ℃로 감소된다, 그리고 프라이머의 상보 적 서열 및 단일 가닥 템플릿 DNA는 짝을 이루어 바인딩합니다..
- 프라이머 확장: Taq DNA 폴리머 라제의 작용으로, DNTP를 반응 기판으로 사용하고 템플릿으로서 표적 서열을 사용합니다., 보완 적 기본 쌍의 원리 및 반 보수적 복제의 원리에 따라, 템플릿 DNA 체인을 보완하는 새로운 반 보존 복제 체인이 합성됩니다.. 이 사슬은 내부의 표적 유전자의 수백만 카피로 증폭 될 수 있습니다. 2 에게 3 변성을 반복하여 시간, 가열 냉각, 확장 프로세스.
PCR 반응 시스템 및 반응 조건 표준 PCR 반응 시스템
| 요소 | 부피/농도 |
|---|---|
| 10x 증폭 버퍼 | 10μl |
| 4 DNTP 혼합물의 유형 | 200μl |
| 프라이머 | 10-100μl |
| 템플릿 DNA | 0.1-2μg |
| TAQ DNA 중합 효소 | 2.5μl |
| mg2+ | 1.5mmol/L |
| 이중 또는 삼중 증류수 | 100μl |
PCR 반응의 5 가지 요소:
- 프라이머 (PCR 프라이머는 DNA 단편이다, 세포 DNA 복제를위한 프라이머는 RNA 사슬이다)
- 효소
- dNTP
- 주형
- 완충액 (mg2+가 필요합니다)
표준 PCR 프로세스는 세 단계로 구성됩니다:
- DNA의 변성 (90° C-96 ° C): 열의 영향으로, 이중 가닥 DNA 주형 파단의 수소 결합, 단일 가닥 DNA 형성.
- 가열 냉각 (25° C-65 ° C): 시스템 온도가 감소합니다, 프라이머가 DNA 주형에 결합하도록 허용합니다, 국소 이중 가닥 지역 형성.
- 확대 (70° C-75 ° C): TAQ 폴리머 라제의 작용으로 (약 72 ° C의 최적 활성), DNTP를 기질로 사용합니다, 확장은 5에서 발생합니다′ 3으로 끝납니다′ 프라이머의 끝, 템플릿에 상보적인 DNA 가닥을 합성합니다.
노트:
- 각주기는 변성을 겪습니다, 가열 냉각, 그리고 확장, DNA의 양을 두 배로 늘립니다.
- 일부 PCR 프로토콜, 짧은 증폭 영역으로 인해, TAQ 폴리머 라제 활성이 최적이 아닌 경우에도 복제를 완료 할 수 있습니다..
- 이 경우, 2 단계 방법을 사용할 수 있습니다, 어닐링과 연장이 60 ° C에서 65 ° C 사이의 온도에서 동시에 발생합니다., 온도 사이클 수를 줄이고 반응 속도 향상.
PCR 반응 특성
강한 특이성
PCR 반응의 특이성은 결정됩니다:
- 템플릿 DNA에 프라이머의 특이적이고 정확한 결합.
- 기본 페어링 원리.
- TAQ DNA 폴리머 라제 합성 반응의 신실함.
- 표적 유전자의 특이성 및 보존.
노트:
- 템플릿에 프라이머를 올바르게 바인딩하는 것이 중요합니다.
- 프라이머를 템플릿에 바인딩하고 프라이머 체인의 확장은베이스 페어링의 원리를 따릅니다..
- 중합 효소 합성 반응의 충실도 및 TAQ DNA 폴리머 라제의 내선은 어닐링을 허용합니다. (재확인) 더 높은 온도에서 발생할 템플릿 및 프라이머의, 결합의 특이성을 크게 증가시키고 증폭 된 표적 유전자 세그먼트에 대한 높은 수준의 정확도 유지.
- 뿐만 아니라, 특이성이 높은 표적 유전자 영역을 선택하여, 특이성 수준이 더욱 증가합니다.
높은 감도
- PCR 제품의 양은 기하 급수적으로 증가합니다, Picograms에서 시작 템플릿 금액의 증폭 활성화 (pg = 10^-12) 마이크로 그램으로 (μg = 10^-6).
- 백만 셀에서 표적 세포를 감지 할 수 있습니다..
- 바이러스 탐지에서, PCR 감도에 도달 할 수 있습니다 3 RFU (재조합 형성 유닛), 세균학에서, 최소 탐지율은입니다 3 박테리아.
간단하고 빠릅니다
- PCR 반응은 열 내성 TAQ DNA 폴리머 라제를 사용합니다.
- 반응 혼합물이 제조되면, 변성, 가열 냉각, 연장 반응은 DNA 증폭 액체 및 수조에서 수행됩니다., 전형적으로 증폭 반응을 완료합니다 2 에게 4 시간.
- 증폭 생성물은 일반적으로 전기 영동에 의해 분석됩니다, 동위 원소를 사용할 필요가 없습니다, 따라서 방사성 오염을 최소화하고 보급을 촉진합니다.
시편에 대한 순도 요구 사항
- 바이러스 나 박테리아 또는 배양 세포를 분리 할 필요가 없습니다.; 조잡한 DNA 및 RNA는 증폭 템플릿으로 사용될 수 있습니다..
- 혈액과 같은 임상 표본, 체액, 담, 머리카락, 세포, 살아있는 조직은 DNA 증폭 검출에 직접 사용될 수 있습니다..
PCR 문제 해결
잘못된 부정
PCR 반응에서 증폭 대역의 부재는 종종 주요 요인에 의해 발생합니다.:
주형 핵산 제조
- 주형의 단백질과 같은 오염 물질, TAQ 폴리머 라제 억제제의 존재, 단백질의 불완전한 제거 (특히 히스톤) 염색체 DNA에서, 템플릿 추출 중 과도한 손실, 또는 페놀 흡입 이이 문제에 기여할 수 있습니다.
- 주형 핵산의 불완전한 변성도 역할을 할 수 있습니다..
- 효소와 프라이머 품질이 좋을 때, 증폭 밴드는 나타나지 않습니다, 템플릿 핵산 추출 과정의 샘플 소화 문제 또는 결함으로 인해 발생할 수 있습니다..
- 효과적이고 안정적인 소화 솔루션을 준비해야합니다, 절차는 고정되어 있어야합니다.
효소 불 활성화
이것은 효소를 새로운 효소로 대체하거나 구식과 새로운 효소의 조합을 사용하여 효소 활성 손실 또는 불충분을 잘못된 부정으로 이끌어 내는지 분석해야 할 수 있습니다.. 때때로, TAQ 폴리머 라제 또는 에티 디움 브로마이드를 추가하는 것을 잊어 버리면 문제가 발생할 수 있습니다..
프라이머 문제
- 프라이머의 품질과 농도, 프라이머 농도의 대칭, 프라이머 합성 품질의 배치 변화는 PCR 결과에 영향을 줄 수 있습니다..
- 솔루션에는 평판이 좋은 프라이머 합성 장치 선택이 포함됩니다, 아가 로스 겔 전기 영동을 통한 프라이머 농도 확인, 두 프라이머 모두에 대해 유사한 밴드 강도를 보장합니다, 분해를 방지하기 위해 작은 분취 량에 고농도로 프라이머를 저장, 프라이머 이량 체 형성과 같은 문제를 방지하기위한 합리적 프라이머 설계 보장.
Mg2+ 농도
MG2+ 이온 농도는 PCR 증폭 효율에 크게 영향을 미칩니다. 과도하거나 부적절한 농도는 특이성 또는 수율에 영향을 줄 수 있습니다, 증폭 실패로 이어집니다.
반응 부피 변화
PCR 부피는 전형적으로 20μl 내지 100μl 범위이다, 목적에 따라. 실패를 방지하기 위해 변경량을 신중하게 조정해야합니다.
물리적 요인
변성이 중요합니다, 부적절한 변성 또는 어닐링 온도로 인해 잘못된 부정이 발생할 수 있습니다.. 표준 온도계를 사용하여 열구 사이클러 또는 수조 온도를 확인하면 고장을 예방할 수 있습니다..
목표 시퀀스 변형
표적 서열의 돌연변이 또는 결실은 프라이머-템플릿 결합에 영향을 줄 수 있습니다., 증폭 실패로 이어집니다.
거짓 긍정
관찰 된 PCR 증폭 대역은 표적 시퀀스 대역과 일치합니다., 때로는 더 균일하고 밝게 나타납니다. 가능한 원인:
부적절한 프라이머 디자인:
비 표적 서열에 대한 상 동성과의 증폭 서열의 선택 PCR 동안 비특이적 증폭 생성물을 초래할 수있다.. 짧은 대상 시퀀스 또는 프라이머는 잘못된 양성으로 이어질 수 있습니다.. 프라이머 재 설계가 필요합니다.
표적 서열 또는 증폭 생성물의 교차 오염:
오염 원인:
- 전체 게놈 또는 큰 세그먼트의 오염은 오 탐지로 이어질 수 있습니다..
- 공기 중의 작은 핵산 조각의 오염도 잘못된 양성을 유발할 수 있습니다.
이 상황을 처리하는 방법
1. 엄격한 실험실 관행:
- 표적 서열이 피펫에 흡입되거나 원심 분리기 외부의 튀는 것을 방지하기 위해주의해서 샘플을 처리합니다..
- 모든 시약과 장비를 자동으로 청소하십시오, 고온에 견딜 수없는 효소 및 물질을 제외하고.
- 오염을 최소화하기 위해 일회용 원심 분리기 및 피펫 팁을 사용하십시오..
2. UV 노출:
- 기존 핵산을 파괴하기 위해 샘플 첨가 전에 반응 튜브 및 시약을 자외선에 노출시킵니다..
- 프라이머 설계 고려 사항:
- 비 표적 시퀀스와의 교차 반응성 가능성을 최소화하기 위해 신중하게 설계 프라이머.
- 중첩 된 PCR 방법:
- 중첩 된 PCR 방법을 구현하여 공기 중의 작은 핵산 조각의 오염으로 인한 오 탐지를 완화하거나 제거합니다..
비특이적 증폭 밴드의 모양
- PCR 증폭 후, 예상되는 밴드와 크기가 일치하지 않는 밴드가 나타납니다., 더 크거나 작습니다, 또는 특정 및 비특이적 밴드 모두 동시에 나타납니다.
- 비특이적 밴드의 모습의 이유는 다음과 같습니다:
- 프라이머와 표적 서열 사이의 불완전한 상보성, 또는 프라이머 이량 체 형성.
- 과도한 mg2+ 이온 농도, 어닐링 온도가 너무 낮습니다, 및 과도한 PCR 사이클 수.
- 효소의 품질과 양, 일부 공급원의 효소로 비특이적 밴드가 발생하기 쉽습니다, 다른 사람들은 그렇지 않습니다.
- 과도한 효소 양은 때때로 비특이적 증폭으로 이어질 수 있습니다.
- 대책에는 포함됩니다:
- 필요한 경우 프라이머 재 설계.
- 효소 수량 감소 또는 다른 공급원의 효소로 전환.
- 프라이머 농도를 낮추기, 템플릿 농도를 적절하게 증가시킵니다, 그리고 사이클 수를 줄입니다.
- 어닐링 온도를 적절하게 높이거나 2 인간 지점 방법을 채택 (93 ° C에서의 변성, 약 65 ° C에서 어닐링 및 연장).
번짐 또는 줄무늬 밴드의 모양
PCR 증폭은 때때로 번잡하거나 줄무늬 밴드를 초래합니다.
- 이것은 종종 과도한 효소 양 또는 불량 효소 품질로 인해 발생합니다., 높은 DNTP 농도, 과도한 mg2+ 농도, 어닐링 온도가 낮습니다, 또는 과도한 사이클 번호.
- 대책에는 포함됩니다:
- 효소 수량 감소 또는 다른 공급원의 효소로 전환.
- DNTP 농도 감소.
- Mg2+ 농도를 적절하게 낮추는 것.
- 템플릿 수량 증가.
- 주기 수 감소.
