Solarbio 환원 글루타티온 (GSH) 콘텐츠 분석 키트

글루타티온 감소 (GSH) 콘텐츠 분석 키트

메모: 테스트 전에 예측을 위해 2~3개의 서로 다른 샘플을 채취합니다..

운영장비: 분광 광도계/마이크로 플레이트 리더

카탈로그 번호: BC1175

크기: 100T/96S

구성요소:

시약 I: 100 밀리리터×1. 4℃에서 보관.

시약 II: 20 밀리리터×1. 4℃에서 보관.

시약 III: 8 밀리리터×1. 4℃에서 보관, 빛으로부터 보호하십시오.

기준: 가루 10 mg × 1. 4℃에서 보관, 빛으로부터 보호하십시오.

제품 설명

글루타티온은 글루탐산으로 구성된 천연 트리 펩티드입니다 (글루), 시스테인 (사이스) 그리고 글리신 (글리). 설페이드릴 그룹을 함유하는 일종의 화합물입니다 (-쉿), 동물 조직에 널리 존재합니다, 식물 조직, 미생물, 그리고 효모. 글루타티온은 5,5와 반응 할 수 있습니다′-디티오비스-(2-니트로 벤조산) (DTNB) 2- 니트로 -5- 메르 캡토 벤조산 및 글루타티온 이황화를 생산합니다 (GSSG). 2-Nitro-5-Mercaptobenzoic acid는 노란 제품입니다, 최대 흡수와 함께 412 nm.

기술 사양

최소 탐지 한계：3.763 μg/mL

선형 범위：12.5-400 μg/mL

필요하지만 제공되지 않는 시약 및 장비

분석 균형, 모르타르/균질화기, 저온 원심분리기, 욕조, 조절 가능한 피펫, 분광 광도계/마이크로플레이트 리더, 마이크로 유리 큐벳 또는 96 잘 평평한 바닥 판과 증류수.

절차

나. 샘플 준비

1. 조직 샘플

신선한 조직을 PBS로 두 번 씻으십시오, 그런 다음 추가 0.1 동물/식물 조직의 g (균질화 제는 시약 I으로 헹구고 사용하기 전에 얼음 위에 놓았습니다.). 추가하다 1 mL의 시약 I (조직 및 시약의 비율은 일정하게 유지 될 수 있습니다.), 얼음 위에서 완전히 분쇄 (액체 질소를 사용하면 분쇄 효과가 향상됩니다). 원심분리기 8000 ×g 10 4℃에서 분, 상청액을 가져 와서 테스트를 위해 4 ℃에 놓으십시오.. (테스트를 일시적으로 완료 할 수없는 경우, 상청액은 -80 ℃에 저장 될 수 있습니다 10 날.)

2. 혈액 샘플

혈장: 샘플은 원심 분리된다 600 ×g 10 4℃에서 분. 동일한 볼륨 시약을 추가하여 상부 혈장을 다른 튜브에 흡수합니다.. 원심분리기 8000 ×g 10 4℃에서 분, 상청액을 가져 와서 테스트를 위해 4 ℃에 놓으십시오. (테스트를 일시적으로 완료 할 수없는 경우, 상청액은 -80 ℃에 저장 될 수 있습니다 10 날.)

혈액 세포: 샘플은 원심 분리된다 600 ×g 10 4℃에서 분. 상부 혈장 폐기, 3 배의 PBS로 세척하십시오 3 타임스 (PBS와 함께 혈액 세포를 재배치하십시오, 원심분리기 600 ×g 10 분), 같은 양의 시약을 추가하십시오 i. 혼합 후, 4 4에 배치됩니다 10 분. 원심분리기 8000 ×g 10 분, 상청액을 가져 와서 테스트를 위해 4 ℃에 놓으십시오.. (테스트를 일시적으로 완료 할 수없는 경우, 상청액은 -80 ℃에 저장 될 수 있습니다 10 날.)

3. 셀 견본

수확 셀은 106 이상이어야하지 않아야합니다. 그런 다음 PBS로 두 번 씻어냅니다. (PBS와 함께 셀을 재배치합니다, 원심분리기 600 ×g 10 분). 내가 첨가 한 시약의 부피는 세포를 재배치하기위한 세포 강수량의 3 배입니다.. 반복적 인 동결과 해동 2 ~ 3 번 (액체 질소에서 얼어 붙은 것이 좋습니다, 37 in 수조에 용해). 원심분리기 8000 ×g 10 분, 상청액을 가져 와서 테스트를 위해 4 ℃에 놓으십시오.. (테스트를 일시적으로 완료 할 수없는 경우, 상청액은 -80 ℃에 저장 될 수 있습니다 10 날.)

II. 절차

1. 예열 분광 광도계/마이크로플레이트 판독기 30 분, 파장을 조정하여 412 nm, 증류수로 0을 설정하다
2. 37 ℃에서 예열 시약 II (포유류 세포) 또는 25℃ (다른 종) 수욕 30
3. 빈 튜브 결정: 마이크로 유리 큐벳을 가져 가십시오, 추가하다 20 증류수 μL, 140 시약 II의 μL, 40 시약 III의 μL 차례로 차례로, 잘 섞다, 장소 2 분, 그리고 측정 412 NM 흡광도 AB.
4. 표준 곡선 만들기

달다 1 표준의 Mg 및 함께 녹인다 1 증류수의 ml 1 mg/mL. 적절한 솔루션을 사용하여 200 μg/mL, 100 μg/mL, 50 μg/mL, 25 μg/ml 및 12.5 μg/mL (표준 용액을 희석하기 전에 10 번 희석 시약).

가져 가라 1.5 ML EP 튜브 및 추가 20 표준 μl, 140 시약 II의 μL 및 40 시약 III의 μL 차례로 차례로. 각 튜브가 균등하게 혼합 된 후, 그것은 서있을 수 있습니다 2 분. 에서 흡광도를 측정합니다. 412 nm, 및 흡광도는 AB를 가로 죽었다. 흡광도에 따라 표준 곡선을 만듭니다 (엑스) 그리고 집중 (와이, μg/mL).

5. 샘플 튜브 테스트: 마이크로 유리 큐벳을 가져 가십시오, 추가하다 20 샘플의 μL, 140 시약 II의 μL, 40 시약 III의 μL 차례로 차례로, 잘 섞다, 그리고 서 있습니다 2 흡광도 ATAT를 테스트하는 데 몇 분 412 nm, ΔA = AT – AB.
6. 마이크로 플레이트 리더의 작동은 분광 광도계의 작동과 동일합니다., 그리고 작동은 빠릅니다

III. 계산

표준 곡선에 따르면, 샘플 ΔA를 공식으로 가져갑니다(엑스), 샘플 농도 y를 계산합니다 (μg/mL).

• 단백질 농도

GSH (μg/mg prot)= y × vrv ÷ vrv ÷ cpr = y ÷ cpr

• 샘플 중량

GSH (μg/g)= y × vrv ÷(vrv ÷ vsv × w)= y ÷ w

• 셀량

GSH (μg/104cell)= y × vrv ÷(vrv ÷ vsv × n)= y ÷ n

• 솔루션 볼륨 GSH (μg/mL)= 2y

N: 셀량, 106;

VSV: 총 상층액 부피, 1 밀리리터；

코드: 상청액 부피가 반응 시스템에 추가되었습니다, 20 μL = 0.02 ml； 여: 샘플 중량, g;

심폐소생술: 상층액 단백질 농도, mg/mL.

2: 혈장의 양 (혈액 세포) 한 번에 희석됩니다.

메모:

1. 샘플은 완전히 균질화되어야합니다. 테스트를 일시적으로 완료 할 수없는 경우, AT-80 ℃에서 저장할 수 있습니다.
2. 기준: 용액이있을 때 감소 된 글루타티온은 준비됩니다
3. 샘플의 GSH 함량이 불확실한 경우, 이전에 여러 그라디언트의 샘플을 희석하십시오
4. 시약이기 때문에 나는 단백질 침전제를 함유하고 있습니다, 상청액은 단백질 농도 측정에 사용될 수 없습니다. 단백질 함량을 결정 해야하는 경우, 다른 조직을 가져 가십시오.

참조:

• alpert a j, 길버트 H f. 재활용 후 반응으로 산화 및 감소 된 글루타티온의 검출[제이]. 분석 생화학, 1985, 144(2):553-562.
• Owens C w i, Belcher r v. 글루타티온의 결정을위한 비색 미세 방법[제이]. 생화학 저널, 1965, 94(3):

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