Solarbio 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 (펩크) 활동 분석 키트

기인하다	세부
메모	테스트 전에 예측을 위해 2~3개의 서로 다른 샘플을 채취합니다.
운영장비	분광 광도계
고양이 번호	BC3310
크기	50T/48S

구성요소:

용액 추출: 60 밀리리터 ×1. 4℃에서 보관.

시약 I: 45 밀리리터×1, stored at 4℃.

시약 II: 가루×1, stored at -20℃ and protected from light. Dissolve it in 35 사용 전 시약 I의 mL. The reagent that cannot be used up shall be stored at -20℃ after repacking, repeat freezing and thawing are prohibited;

시약 III: 45 μL×1, stored at 4℃ and protected from light. Before temporary use, add distilled water to dilute according to the volume ratio of 1:120, to prepare when the solution will be used.

시약 IV: 155 μL×1, stored at 4℃ and protected from light. Before temporary use, add distilled water to dilute according to the volume ratio of 7:250, to prepare when the solution will be used.

시약 V: 가루×1, stored at -20℃ and protected from light. Dissolve it in 2.5 사용 전 증류수 mL, the reagent that cannot be used up shall be stored at -20℃ after repacking, repeat freezing and thawing are prohibited;

제품 설명:

펩크 (EC 4.1.1.32) 동물에게서 널리 발견된다, flowering plants, algae, some fungi, and bacteria. The enzyme catalyzes the conversion of oxaloacetic acid to phosphoenolpyruvate, which is the first-rate limiting enzyme regulating gluconeogenesis.

PEPCK catalyzes oxaloacetic acid to form phosphoenolpyruvate and CO2, pyruvate kinase and lactate dehydrogenase further catalyze the oxidation of NADH to NAD+ in turn, and determine the NADH decline rate at 340 nm, which can reflect the PEPCK activity.

필요하지만 제공되지 않는 시약 및 장비

분광 광도계, 저온 원심분리기, water bath pot, 1 mL 석영 큐벳, 조절 가능한 피펫, 모르타르/균질화기, 얼음과 증류수

절차

나. 조효소액 추출:

1. 1. 조직 샘플:

조직 질량의 비율 (g): volume of extract solution (밀리리터): 1:5~10 (무게를 측정하는 것이 좋습니다 0.1 g의 조직, 추가하다 1 mL of extract solution) for ice bath homogenate, then centrifugate at 8000 ×g 10 4℃에서 분, 상등액을 채취하여 얼음 위에 올려 놓고 테스트해 보세요..

2. 박테리아 또는 배양된 세포:

첫 번째, collect bacteria or cells into the centrifuge tube, and then discard the supernatant. 세포의 수 (104): the volume of the extract (밀리리터) ~이다 500-1000:1 (1 mL of the extract solution is recommended to be added to 5 백만 박테리아 또는 세포), 얼음조에서 초음파로 세포를 파괴합니다. (힘: 200W or 20%, 초음파:3에스, 간격:10에스, 반복하다 30 타임스). Then centrifuged at 8000 ×g 10 4℃에서 분, 상등액을 채취하여 얼음 위에 올려 놓고 테스트해 보세요..

3. 혈청 샘플: 직접 결정.

II. 시험 절차:

1. 분광 광도계를 1시간 이상 예열합니다. 30 분, 파장을 조정하여 340 nm, and adjust to zero with distilled
2. 작업 솔루션: mix Reagent II, 시약 III, Reagent IV in the proportion of 7:1:1(V:V:V) 사용하기 전에. 솔루션 사용 시기 준비.
3. Preheat the working solution at 37℃ (포유 동물) 또는 25 ℃ (다른 종) ~을 위한 5 분.
4. 작업 테이블: Add the following reagents to the 1 mL quartz cuvette in turn:

시약명 (µL)	빈 튜브(비)	시험관(티)
견본	–	50
증류수	50
작업 솔루션	900	900
시약 V	50	50
Add Reagent V and mix it immediately. 흡광도 값 A1을 측정하십시오 340 nm for 10s and A2 at 70s. ΔAT = A1T를 계산합니다- A2T, ΔAB= A1B- A2B, and ΔA =ΔAT-ΔAB. Blank tube only needs to be done once or twice.

III. 계산 펩크:

1. Calculation by micro quartz cuvette

• 조직 단백질 농도로 계산:

효소 활성의 정의: one unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1 nmol of NADH per minute, 단백질 1mg당.

PEPCK activity (U/mg 프로트) = ΔA ¼(ε×d)×VRT×109 ¼ (VS× 심폐소생술) ÷ T =3215.4×ΔA÷Cpr

• 조직 샘플의 품질로 계산:

효소 활성의 정의: one unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1 nmol of NADH per minute, 샘플 1g당.

PEPCK activity (U/g 신선 중량) = ΔA ¼(ε×d)×VRT×109 ¼ (VS│VST×W) ÷T= 3215.4×ΔA÷W

• 세포 수별:

효소 활성의 정의: one unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1 nmol of NADH per minute every 10 thousand cells

PEPCK activity (U/104 셀)=ΔA π(ε×d)×VRV×109¶(VS²VST×500)÷T=6.43×ΔA

• 혈청량으로 계산:

효소 활성의 정의: one unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that catalyzes the consumption of 1 nmol of NADH per minute every milliliter of serum

PEPCK activity (U/mL) = ΔA ¼(ε×d)×VRV×109÷VS÷T=3215.4×ΔA

이자형: NADH의 몰흡광계수, 6.22×103L/몰/cm; 디: 큐벳의 가벼운 직경, 1 센티미터;

VRT: 반응 시스템의 총 부피, 0.001 엘;

VS: 반응 시스템의 샘플 부피, 0.05 밀리리터; VST: 추출액의 부피, 1 밀리리터;

심폐소생술: 샘플 단백질 농도, mg/mL, Self-determination of protein concentration; 여: 샘플 질량의 질량, g;

티: 반응 시간, 1 분;

500: 박테리아 또는 세포의 총 수, 5 백만; 109: 단위 환산 계수, 1 mol = 109 nmol.

메모:

1. A1이 적은 경우 1 또는 ΔA는보다 큽니다 0.6, it is recommended to dilute the sample to a proper multiple before determination to improve the detection
2. For samples with high enzyme activity, such as animal liver, kidney and other tissues, it is recommended to dilute the extract to 5 times or more for
3. The blank tube is a test well for testing the quality of each reagent component. 정상적인 조건에서, the change does not exceed06.
4. The steps of sample adding and mixing shall be rapid, and the stopwatch timing shall be accurate. If conditions permit, it is recommended that two persons cooperate to complete this

실험예:

1. Take 0.1g liver and add 1 ml extract solution for homogenate. Take the supernatant and dilute it twice with the extract solution. 그런 다음 결정 단계에 따라 작동하십시오.. Measure and calculate: ΔAT= A1D- A2D= 1.175-0.532=0.643, ΔAB= A1B – A2B =1.29-1.244=0.046, ΔA = ΔAT – ΔAB = 0.643-0.046 = 0.597

PEPCK activity (U/g 질량) = 3215.4×ΔA÷W×10 (희석비율) = 3215.4×0.597÷0.1×10=191959.4 U/g mass.

2. Take 0.1g aloe vera and add 1 ml extract solution for homogenization, take the supernatant and operate according to the determination steps. Measure and calculate ΔAT = A1T- A2T =1.257-1.106=0.151, ΔAB= A1B- A2B =1.29-1.244=0.046, ΔA = ΔAT – ΔAB =0.151-0.046=0.105

PEPCK activity (U/g 질량) = 3215.4 × ΔA÷W =3215.4×0.105÷0.1=3376.17 U/g mass.

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