Solarbio 산화 글루타티온 (GSSG) 콘텐츠 분석 키트

산화된 글루타티온 (GSSG) 콘텐츠 분석 키트

메모: 테스트 전에 예측을 위해 2~3개의 서로 다른 샘플을 채취합니다..

운영장비: 분광 광도계/마이크로플레이트 리더

카탈로그 번호: BC1185

크기:100T/96S

구성요소:

시약 I:100 밀리리터×1. 4℃에서 보관. 시약 II: 130 μL×1. 4℃에서 보관. 시약 III: 20 밀리리터×1. 4℃에서 보관. 시약 IV:2.5 밀리리터×1. 4℃에서 보관.

시약 V: 분말 × 1. 4℃에서 보관. 함께 용해 2.5 용액을 사용할 경우 증류수 mL, 그런 다음 더 작은 패키지로 나뉩니다, -20℃에 보관.

시약 VI:12.5 μL×1. 4℃에서 보관. 비율의 샘플 크기에 따라 시약 VI 및 증류수를 준비합니다. 1:20 (V: V) 사용하기 전에.

기준: 가루 10 mg × 1. 4℃에서 보관.

제품 설명

산화된 글루타티온(GSSG) 글루타티온의 산화 된 형태입니다 (GSH), Dithioneglutathione이라고도합니다, 글루타티온의 두 분자의 산화에 의해 형성된다. GSSG는 글루타티온 환원 효소에 의해 GSH로 감소된다, 그래서 대부분의 신체는 감소 된 형태입니다.. GSH 및 GSSG 함량의 결정 및 세포에서 GSH/GSSG의 비율은 세포의 산화 환원 상태를 반영 할 수 있습니다.. 이 키트는 글루타티온의 반응을 사용합니다 5, 5′-디티오비스 -2- 니트로 베노 산 (DTNB) 5- 티오 -2를 생산합니다- 니트로 벤조산. 5-thio-2- 니트로 벤조산은 파장에서 가장 큰 흡수를 갖는다 412 nm, 및 2- 비닐 피리딘은 샘플의 원본에서 감소 된 글루타티온 억제, 그런 다음 글루타티온 환원 효소를 사용하여 GSSG를 GSH로 줄입니다., 산화 된 글루타티온의 함량 결정.

기술 사양

최소 탐지 한계：3.211 μg/mL

선형 범위：3.9-125 μg/mL

필요하지만 제공되지 않는 시약 및 장비.

분석 균형, 모르타르/균질화기, 냉장 원심 분리기, 욕조, 조절 가능한 피펫, 분광 광도계/ 마이크로 플레이트 리더, 마이크로 유리 큐벳/96웰 평면 바닥 플레이트.

절차

나. 견본 준비

1. 1. 조직 샘플

신선한 조직을 PBS로 두 번 씻으십시오, 그런 다음 추가 0.1 균질화 제에 샘플의 G (균질화 제는 시약 I으로 헹구고 사용하기 전에 얼음 위에 놓았습니다.). 추가하다 1 mL의 시약 I (조직 및 시약의 비율은 일정하게 유지 될 수 있습니다.), 얼음 위에서 완전히 분쇄 (액체 질소를 사용하면 분쇄 효과가 향상됩니다). 원심분리기 8000 × g 및 4 4 10 분, 상청액을 가져 와서 테스트를 위해 4 ℃에 놓으십시오.. (상청액은 -80 ℃에 저장 될 수 있습니다 10 날.)

2. 혈액 샘플

혈장: 샘플은 원심 분리된다 600 × g 및 4 4 10 분. 상부 플라즈마를 다른 튜브에 흡수하면 동일한 볼륨 시약 I을 추가합니다.. 원심분리기 8000 × g 및 4 4 10 분, 상청액을 가져 와서 테스트를 위해 4 ℃에 놓으십시오.. (상청액은 -80 ℃에 저장 될 수 있습니다 10 날.)

혈액 세포:샘플은 원심 분리된다 600 × g 및 4 4 10 분. 상부 혈장 폐기, 고음량의 PBS로 세척하십시오 3 타임스 (PBS 원심 분리기와 혈액 세포를 혼합하십시오 600 ×g 10 분), 같은 양의 시약을 추가하십시오 i. 혼합 후, 4 4에 배치됩니다 10 분. 원심분리기 8000 ×g 10 분, 상청액을 가져 와서 테스트를 위해 4 ℃에 놓으십시오.. (상청액은 -80 ℃에 저장 될 수 있습니다 10 날.)

3. 세포 샘플

수확 셀은 106 이상이어야하지 않아야하며 PBS로 두 번 씻으십시오. (600 × g에서 PBS 원심 분리기와 세포를 혼합하십시오 10 분), PBS의 부피와 침전 된 세포를 혼합하십시오 3 타임스. 반복적 인 동결과 해동 2 ~ 3 번 (액체 질소에서 냉동을 제안하십시오, 37 in 수조에 용해). 원심분리기 8000 ×g 10 분, 상청액을 가져 와서 테스트를 위해 4 ℃에 놓으십시오.. (상청액은 -80 ℃에 저장 될 수 있습니다 10 날.)

II. 절차

1. 예열 분광 광도계/마이크로플레이트 판독기 30 분, 파장을 조정하여 412 nm, 증류수로 카운터를 0으로 설정
2. 수조에서 시약 II 예열 30 분: 37℃ (포유류 세포) 또는 25℃ (다른 종).
3. 표준 희석: 표준을 용해하십시오 1 증류수 1mL (4℃) 농도로 10 mg/mL. 125μg/ml의 농도 표준을 준비하기 위해 적절한 솔루션을 섭취하십시오.、 5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、7.8125μg/mL、3.90625μg/mland0μg/ml (희석제는 10 배 희석 된 시약 i이다).

4. 추가하다 20 희석 된 표준 또는 샘플의 μl 0.5 ML 원심 분리 튜브, 추가하다 1 시약 II의 μL, 인큐베이션 37 ℃ 30 혼합 후 몇 분.
5. 표준 곡선을 만드십시오

인큐베이션 후, 추가하다 140 시약의 μL III, 20 시약 IV의 μL, 20시약 v, 그리고 2 시약 VI의 μL 표준 튜브에 순서대로. 빠른 혼합 후, 광 흡수 A1 및 A2의 30 S와 150 s는 각각에서 측정되었다 412 nm. 흡광도 (A2-A1) 가축성입니다 (엑스) 그리고 집중력은 안수입니다 (와이), 표준 곡선 만들기.

추가하다 140 시약의 μL III, 20 시약 IV의 μL, 20 시약 v, 그리고 2 μLOF 시약 VI에 샘플 튜브에 순서대로. 빠른 혼합 후, 광 흡수 A1 및 A2의 30 S와 150 s는 각각에서 측정되었다 412 nm, ΔA = A2- A1.

III. 계산

표준 곡선에 따르면, ΔA를 공식으로 샘플링하십시오 (엑스), y의 샘플 농도를 계산하십시오

(μg/ml).

• 단백질 농도

GSSH (μg / MG PROT)= y × vrv ÷ vrv ÷ cpr = y ÷ cpr

• 샘플 중량

GSSH (μg /g)= y × vrv ÷(vrv ÷ vsv × w)= y ÷ w

• 셀라마운트

GSSH (μg /106 셀)= y × vrv ÷(vrv ÷ vsv × n)= y ÷ n

• 솔루션 볼륨

GSSH (μg / 밀리리터)= y × vrv/vs = 2y

N: 셀량,106；

로프: 총 반응량, 0.203 밀리리터；

VSV: 상청액의 부피는 반응 시스템에 추가되었습니다., 20 μL = 0.02 ml； 여: 샘플 중량, g;

심폐소생술: 상층액 단백질 농도, mg/mL.

노트:

1. 샘플은 완전히 균질화되어야합니다. 테스트를 일시적으로 완료 할 수없는 경우, AT-80 ℃에서 저장할 수 있습니다.
2. 샘플에서 GSSG 컨텐츠의 내용이 불확실한 경우, 측정 전에 여러 기울기를 희석 할 수 있습니다.
3. 이 방법은 효소 반응 속도를 사용하여 기질 농도를 계산하고 가능한 한 정확하게 판독 값을 계산합니다. 30 그리고 150
4. 시약 나는 단백질 침전제를 함유했다, 상청액은 단백질 농도 결정에 사용될 수 없었습니다.. 단백질 함량을 결정 해야하는 경우, 다른 조직을 가져 가십시오.

참조:

• alpert a j, 길버트 H f. 재활용 후 반응으로 산화 및 감소 된 글루타티온의 검출[제이]. 분석 생화학, 1985, 144(2):553-562.
• Owens C w i, Belcher r 글루타티온의 결정을위한 비색 미세 방법[제이]. 생화학 저널, 1965, 94(3): 705.

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