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제품소개：
이 시약 키트는 깃털과 같은 샘플에서 CHD-W 보존 유전자를 증폭하고 검출할 수 있습니다., 피, 그리고 앵무새의 조직, 이로써 그들의 성별을 결정한다.. 내생적 내부 참조를 도입함으로써, 검사 결과의 정확성을 보장하기 위해 핵산 추출 및 증폭 과정을 모니터링할 수 있습니다..
상품 내용：
| 시약 구성 요소 | AN2304001-01(24T) | AN2304001-02(48T) |
| CW 반응 용액 | 23µL/웰×8웰/스트립×3스트립 | 23µL/웰×8웰/스트립×6팁 |
| CW 양성 대조군 | 100μL | 100μL |
| 음성 대조군 | 100μL | 100μL |
보관 조건：
-20℃에 보관, 유통기한은 적어도 12 개월
실험적 운영：
1. 샘플 준비 (시료 준비 영역)
1.1 샘플 요구사항：
깃털: 최소한 수집 5 가슴에서 나온 깃털, 복부, 아니면 다리 (깃털 샤프트 부분을 포함하여), 자연적으로 떨어진 깃털을 사용하지 마세요..
피: EDTA를 항응고제로 사용, 헤파린을 항응고제로 사용하지 마십시오. 신선한 전혈을 사용해야 합니다., 또는 최대 2~8℃에서 보관 가능합니다. 7 날, 또는 최대 -20℃에서 보관 3 개월. 가능한 한 반복적인 냉동과 해동을 피하세요.
조직: 신선한 근육이나 장기 조직을 채취합니다. (피부에 샘플을 사용하지 마십시오, 힘줄, 또는 처리하기 어려운 근막) 100mg 이하. 200-500μL의 멸균수를 사용하여 조직 균질액을 준비합니다., 그런 다음 후속 샘플 준비를 진행합니다..
1.2 샘플 준비：
삼사자바이오텍을 참고해주세요 “동물 게놈 DNA 신속 추출 키트 (~을 위한 PCR 분석)” 수동 (부품 번호: DP202), 또는 관련 요구 사항을 충족하는 기타 핵산 추출 키트/방법, 처리된 샘플을 추출하기 위해. 추출된 검체핵산을 아이스박스에 넣어 신속하게 검사를 진행해 보세요.. 최대 4°C에서 보관할 수 있습니다. 7 일 또는 -20°C에서 최대 6 개월.
2 . 반응 시스템의 준비 (샘플 추가를 위한 반응 영역).
2.1 CW 양성 대조군이 들어 있는 n+2 반응 튜브를 꺼냅니다., CW 음성 대조군, 그리고 실험에 필요한 반응액 (n은 테스트할 샘플 수를 나타냅니다., ...을 더한 1 양성 대조군, 그리고 1 음성 대조군). 시약을 실온에서 완전히 녹입니다., 원심분리기 10 초, 튜브 벽과 캡 내부의 액체를 튜브 바닥으로 회전시킵니다.. 나중에 사용할 수 있도록 아이스박스에 넣어두세요.
2.2 그 다음에, 2μL의 음성 대조군 추가, 추출된 샘플 핵산, 그리고 순차적으로 반응 용액에 대한 CW 양성 대조. 튜브 캡을 닫습니다., 제대로 된 기록을 남기다, 각 반응의 총 부피가 25μL인지 확인하십시오.. 내용물을 잘 섞어주세요, 원심분리기 10 초, 그런 다음 PCR 장비에서 증폭 실험을 진행합니다..
3. PCR 증폭 (증폭 및 제품 분석 영역).
95°C에서 사전 변성 3 분; 95°C에서 변성 10 초, 58°C에서 어닐링 및 신장 30 초, ~을 위한 35 사이클, 58°C에서 형광 신호 수집. 형광 채널 1 FAM으로 설정해야 합니다 (CHD-W 유전자), 및 채널 2 VIC/HEX로 설정해야 합니다. (내인성 참조 유전자) (ABI 시리즈 실시간 형광 정량 PCR 기기를 사용하는 경우, 필요하다면, 사전에 제조업체에 문의하거나 직접 ROX 교정 염료를 추가하십시오.; 그렇지 않으면, 정상적인 절차를 따르세요).
4. 결과판정
4.1 FAM 채널과 VIC/HEX 채널 모두에서 양성 대조군의 Ct 값이 <28 그리고 보여주다 “에스”-모양의 증폭 곡선, 음성 대조군은 Ct 값이 없거나 Ct 값 ≥35이고 “에스”-모양의 증폭 곡선, 실험 결과는 유효하다. 그렇지 않으면, 실험은 반복되어야 한다, 그리고 반복 실험이 여전히 유효하지 않은 경우, 제조업체의 기술 담당자에게 문의하십시오..
4.2 VIC/HEX 채널에 있는 샘플의 Ct 값은 ≤30이어야 하며 다음을 표시해야 합니다. “에스”-모양의 증폭 곡선, 시료 추출 및 증폭이 효과적임을 나타냅니다.. Ct 값이 없거나 Ct 값이 30 < 코네티컷 ≤ 35 VIC/HEX 채널에서, 이는 샘플 핵산 추출이 표준에 미치지 못하거나 강한 억제 간섭이 있음을 나타냅니다. (알코올이나 소독제 잔류물 등, 항응고제, 등.) 증폭을 방해하는 것. 핵산 추출 및 증폭을 위해 시료를 재처리하는 것이 좋습니다..
4.3 VIC/HEX 채널 감지가 유효한 후, FAM 채널에서의 결정은 다음과 같이 수행됩니다.:
- Ct 값 ≤ 30 그리고 “에스”-모양의 증폭 곡선이 관찰됩니다, 두 채널 간의 Ct 차이는 다음보다 작습니다. 5, CHD-W 유전자 양성으로 판정됨, 샘플이 여성에게서 나온 것임을 나타냅니다..
- Ct 값 ≤ 30 그리고 “에스”-모양의 증폭 곡선이 관찰됩니다, 그러나 두 채널 간의 Ct 차이는 ≥입니다. 5, 또는 Ct 값은 30 < 코네티컷 < 32, 모두 의심스러운 것으로 간주됩니다., 그리고 재검사를 권장합니다 (먼저 제외하는 것이 좋습니다. “위양성” 환경 에어로졸 오염으로 인한 결과, 핵산 추출 및 검사를 진행합니다.). 에어로졸 오염을 제외하고 FAM 채널에서 재검사한 결과 Ct 값이 나타나는 경우 < 30 명확한 증폭 곡선, 두 채널 간의 Ct 차이는 다음보다 작습니다. 5, CHD-W 유전자 양성으로 판정됨; 그렇지 않으면, 부정적으로 판단됩니다.
- Ct 값 없음 또는 Ct 값 ≥ 32 그리고 아니 “에스”-모양의 증폭 곡선, CHD-W 유전자에 대해 음성으로 결정됩니다., 샘플이 남성에게서 나올 수 있음을 나타냅니다..
지침：
1)오염을 방지하기 위해, 실험은 분할된 작업으로 엄격하게 수행되어야 합니다.. 인적 요인으로 인한 교차 오염을 방지하기 위해 파티션 간을 물리적으로 격리하는 것이 바람직합니다.. 실험 중에는 실험실 가운과 라텍스 장갑을 착용하십시오., 다양한 영역에서 별도의 도구를 사용합니다.. 필요에 따라 장갑과 실험복을 갈아입습니다.. PCR 후, 즉시 뚜껑을 열지 마십시오. 에어로졸 오염을 최소화하기 위해 샘플링을 시작하기 전에 충분히 냉각될 때까지 기다리십시오..
2)사용하기 전에 시약을 완전히 해동하십시오, 그러나 반복적인 냉동과 해동을 피하십시오. 시약 준비에 대한 지침을 엄격히 따르십시오., 샘플 추가, 그리고 다른 단계. 작업대, 원심분리기, 피펫, 및 기타 기구는 염소 함유 소독제를 사용하여 정기적으로 소독해야 합니다., 에탄올, 핵산 오염 제거제, 아니면 자외선 램프.
3)음성 결과가 반드시 남성을 의미하는 것은 아닙니다.. 알려지지 않은 돌연변이, 샘플 품질이 좋지 않음, 낮은 농도, 또는 핵산 추출에 강력한 억제 물질이 존재하는 경우 (테스트) 또한 다음으로 이어질 수 있습니다. “부정적인” 결과. 이 키트는 앵무새의 CHD-W 유전자의 특정 증폭에만 사용됩니다.. 다른 제품의 경우, 제조사에 문의해주세요.
4)본 제품은 일회용입니다. 얼었다 녹았다를 반복하지 마세요. 이는 과학적 연구 목적으로만 사용되며 임상 진단이나 기타 목적으로 사용되어서는 안 됩니다..
