실험 설계
실험에는 식물 재료를 분쇄하고 정제하여 조악한 DNA 추출물을 얻는 것이 포함됩니다.. 이 추출물은 침전물에 존재하는 DNA를 식별하는 데 사용됩니다..
원유 추출
조 DNA의 용해도는 처음에는 감소하다가 NaCl 농도가 증가함에 따라 증가합니다., 농도에서 최소에 도달 0.14 정부.
조 DNA 추출물에 에탄올 용액을 첨가하면 DNA가 침전됩니다.. NaCl 농도에서는 0.14 연삭 용액의 mol/L, DNA의 용해도는 최소이다, 이는 분쇄 중 DNA 용해에는 적합하지 않지만 DNA 침전을 촉진합니다.. 반면에, NaCl 농도에서 2 연삭 용액의 mol/L, DNA 용해도가 더 높습니다., DNA 용해를 돕는다, 그러나 침전 효과는 낮은 NaCl 농도의 분쇄 용액만큼 좋지 않습니다.. 그러므로, 조 DNA 추출에 대한 분쇄 용액의 다양한 NaCl 농도의 영향에 대한 추가 분석이 필요합니다..
정화
불순물 제거 방법에는 원심분리가 포함됩니다., 75°C 수조, 그리고 춥다 (4℃) 고정. 조 DNA 추출물을 원심분리하면 원심분리관 바닥에 세포조각과 단백질 침전물이 분리됩니다., 대부분의 DNA는 상청액에 남아 있지만. DNA와 단백질의 내열성 차이를 이용하여, DNA 추출물을 75°C로 유지합니다. 10 수조에 몇 분 동안 담그면 단백질 변성과 침전이 발생합니다.. 4°C의 저온 침전으로 인해 단백질이 더 침전됩니다., 다당류, 그리고 다른 물질, 불순물 제거 달성.
신분증
산성 용액에서 DNA를 가열하면 분자 내 2-데옥시리보스 잔기가 분해됩니다., 그 결과 2-데옥시리보스와 Ω-하이드록시-γ-케토발레르알데히드가 형성됩니다.. 후자는 디페닐아민과 반응하여 파란색 화합물을 생성합니다.. 이 반응은 미리 NaCl 용액에 DNA를 용해시킬 필요 없이 발생합니다..
이 실험에는 DNA의 조잡한 추출이 포함됩니다., 그리고 설탕, 단백질, DNA 시료 내 유도체도 디페닐아민과 함께 다양한 색상의 물질을 형성할 수 있습니다.. 그러므로, 디페닐아민법은 정확한 동정법이 아닙니다.. 핵산과 단백질은 다음 파장의 자외선 범위에서 최대 흡수를 갖습니다. 260 nm 및 280 nm, 각기. DNA 농도는 흡광도를 통해 간접적으로 계산할 수 있습니다. 260 nm: DNA 농도 (μg/mL) =A260× 100 × 50. 추가적으로, A260과 A280의 비율을 계산하면 DNA 순도를 평가할 수 있습니다.. 순수한 DNA의 A260/A280 비율은 다음과 같습니다. 1.8, 이 비율은 단백질 오염이 있는 경우 크게 감소합니다..
퇴적물 품질을 비교하여, DNA 농도, 그리고 순수함, 두 세트의 시험관 사이의 디페닐아민 식별의 색상 변화, DNA 추출을 위한 다양한 실험적 처리의 효과를 분석할 수 있습니다..
재료 및 방법
실험 준비
장비: 페트리 접시, 비커, 눈금 실린더, 유리 막대, 일종의 투박한 무명, 절구와 유봉, 시험관, 테스트 튜브 랙, 깔때기, 전자저울, 분석저울, 원심분리기 튜브, 원심분리기 기계, 욕조, NanoDrop Lite 초현미경 핵산/단백질 분석기, 신선한 콜리플라워.
시약: 95% -20°C에서 냉동된 에탄올, 디페닐아민 시약.
그라인딩 솔루션: 디졸브 1.01 g 트리스 (하이드록시메틸) 아미노메탄 5 증류수 1mL, pH를 조정하다 8.0 사용하여 2 mol/L 염산, 그런 다음 추가 0.876 (또는 11.69) 염화나트륨(g), 3.72 g 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 그리고 2 g 나트륨 도데실 황산염 (SDS). 위의 약품을 모두 녹인 후, 볼륨을 만들어라 100 mL(증류수 포함).
방법 단계
① 분쇄 및 여과: NaCl 농도의 분쇄 용액으로 콜리플라워를 분쇄합니다. 0.14 mol/L 및 2 정부, 그런 다음 여과하여 상층액을 수집합니다..
② 불순물 제거: 불순물 제거를 위해 세 가지 다른 방법으로 상층액을 처리합니다., 즉 원심분리, 75°C 수조 + 4°C 정착, 또는 단지 4°C 정착. 원심분리 매개변수는 다음과 같습니다. 3,000 rpm, 2 분, 실온에서. “75°C 수조 + 4°C 정착” 시험관을 상층액과 함께 75°C 수조에 담그는 작업이 포함됩니다. 10 분, 그 후 4°C 냉장고에 계속 넣어두었습니다. 10 분. “4°C만 침전됨” 상층액을 4°C 냉장고에 넣는 것을 의미합니다. 10 분.
③ 강수량: 시험관에 같은 양의 차가운 에탄올을 붓는다., 그리고 해결하자. 흰색 응집 물질이 나타나면, 핀셋을 사용하여 침전물을 제거합니다., 공기 건조, 그리고 무게를 잰다.
④ 신분증: NanoDrop Lite 초현미경 핵산/단백질 분석기를 사용하여 DNA 농도를 측정하고 샘플의 DNA 순도를 분석합니다.. 정성적 식별은 디페닐아민 시약을 사용하여 수행됩니다.. 샘플은 디페닐아민 식별 전에 용해되지 않거나 다음 농도의 NaCl 용액에 용해되지 않습니다. 2 다양한 부피의 mol/L.
권장 사항
분쇄액 NaCl 농도 최적화
실험 결과는, DNA 농도나 순도 측면에서, NaCl 농도가 다음과 같은 분쇄 용액을 사용하면 DNA 추출 효율이 더 좋습니다. 2 mol/L 비교 0.14 정부. 이는 NaCl 농도가 2 정부, DNA의 용해도가 더 높다. NaCl 농도가 낮음에도 불구하고 0.14 mol/L은 나중에 DNA 침전에 더 유리합니다. (비교하다 2 정부), 에탄올의 작용으로 인해 효과가 약함. 추가적으로, NaCl 농도가 높을수록 염 효과가 발생할 수 있습니다., 단백질 침전 촉진, 이는 유익하다 DNA 정제. 그러므로, 연삭 용액 NaCl 농도를 선택하는 것이 좋습니다. 2 정부.
불순물 제거 방법의 최적화
실험 결과는 다양한 불순물 제거 방법에 장단점이 있음을 나타냅니다., 단백질을 제거하는 동안 일부 DNA 손실이 발생합니다.. DNA 순도 분석, 원심분리가 최적이다; DNA 농도로부터, 4°C 정착이 최적입니다.; 비용과 운영상의 어려움을 고려하여, 4°C 정착이 최적입니다.. 그러므로, 세 가지 불순물 제거 방법이 실험 결과에 미치는 영향은 유사합니다., 하지만 4°C 정착은 비용 효과적입니다., 조작이 편리하다, 시간과 비용이 제한적일 때 실용적입니다..
침전물 처리 최적화
실험 결과는 식별 결과가 다음과 같을 때 더 좋다는 것을 보여줍니다. “침전물을 용해시키지 않음.” 이는 디페닐아민이 물과 접촉할 때 유백색 용액을 형성하기 때문일 수 있습니다., 회색-청색 관찰을 방해함. 또한, 용액을 희석하면 색상이 더 밝아질 수 있습니다., 뚜렷한 현상을 관찰하기 어렵게 만든다.. 뿐만 아니라, 디페닐아민은 서로 흡착할 수 있습니다., 흰색의 작은 입자를 형성, 색상 반응을 방해. 하지만, 식별을 위해 디페닐아민 시약에 침전물을 직접 추가하거나 소량의 침전물을 용해시키는 것이 좋습니다. 2 식별용 mol/L NaCl 용액 (권장 부피는 디페닐아민 부피의 1/4입니다.). 이 접근법은 침전물 용해로 인한 식별 감도 감소를 방지합니다..
