~ 안에 1974, Evans는 위치 파악 정확도를 향상시키기 위해 최초로 염색체 밴딩 기술과 현장 혼성화를 결합했습니다.. 1970년대 후반, 연구원들은 형광-표지 된 현장 혼성화를 탐색하기 시작했습니다, 물고기로 알려져 있습니다. ~ 안에 1981, Harper는 단일 -Copy DNA 서열을 G-Banded 시편에 성공적으로 국한했습니다., 염색체 국소화 기술의 상당한 진전을 표시합니다. 1990 년대에는 인간 게놈 프로젝트의 일환으로 고해상도 인간 게놈 매핑이 필요하기 때문에 빠른 발전과 어류의 적용이 발생했습니다..
1. 원칙
물고기 (현장 하이브리드 화 형광) 중요한 비 방사성 in situ 하이브리드 화 기술입니다. 물고기의 기본 원리는 염색체 또는 DNA 섬유 섹션의 표적 DNA가 상 동성이고 사용 된 핵산 프로브에 상보적인 경우, 변성 후 하이브리드를 형성 할 수 있습니다, 가열 냉각, 그리고 Renuration.
핵산 프로브에서 뉴클레오티드 중 하나를 비오틴 또는 디 옥시 게닌과 같은 리포터 분자로 표지함으로써, 리포터 분자와 형광 표지 된 아비딘 사이의 특이 적 면역 화학 반응은 질적에 이용 될 수 있습니다., 정량적, 또는 형광 검출 시스템 하에서 표적 DNA의 상대 위치 분석.
2. 실험적 절차
- 물고기에 대한 샘플 준비
- 프로브 준비
- 프로브 라벨링
- 이종 교잡
- (염색체 밴딩)
- 형광 현미경 검출
- 결과 분석
3. 형질
현장 하이브리드 화 프로브는 사용 된 라벨링 분자의 유형에 따라 방사성 및 비 방사성으로 나눌 수 있습니다.. 방사성 프로브는 샘플 준비에 대한 수요가 적다는 장점이 있으며 노출 시간을 연장하여 신호 강도를 향상시킬 수 있습니다., 비교적 민감하게 만듭니다. 하지만, 방사성 프로브는 불안정합니다, 자동 방사선 촬영 시간이 길다, 산란 된 방사선은 공간 분해능이 낮습니다, 동위 원소 작동을 번거롭게 만듭니다.
형광 표지 시스템은 이러한 단점을 극복합니다, 어류 기술 개발로 이어집니다. 비 방사성 검출 시스템으로서, 물고기는 몇 가지 장점이 있습니다:
- 경제적이고 안전한 형광 시약 및 프로브
- 단일 라벨링 후 최대 2 년 동안 사용할 수있는 안정적인 프로브
- 빠른 결과로 짧은 실험주기, 높은 특이성, 그리고 정확한 현지화
- 물고기는 DNA 서열을 작게 찾을 수 있습니다 1 방사성 프로브와 비슷한 감도를 갖는 KB
- 다색 물고기는 동일한 핵 내에서 다른 색상을 표시하여 여러 시퀀스를 동시에 감지 할 수 있습니다.
- 슬라이드 상에 중기 염색체의 수 또는 구조의 변화와 현탁액에서의 간 염색체 DNA의 구조를 표시 할 수 있습니다.
단점:
- 혼성화 효율은 도달하지 않습니다 100%, 특히 더 짧은 cDNA 프로브를 사용할 때.
4. 응용
어류 기술은 알려진 유전자 또는 서열의 염색체 국소화에 사용될 수 있습니다., 또한 냉방 유전자를 연구합니다, 유전적 표지, 염색체 이상. 유전자 자격과 관련된 연구에서 특히 유리합니다, 부량, 완성, 그리고 표현.
어류 기술 개발
1. 탐지 사이트 및 목표 수의 개발
기본 어류 기술을 설립 한 후, 물고기는 단일 유전자 또는 핵산 검출에 사용되었을뿐만 아니라 여러 유전자 부위의 동시 검출을 위해 다색 물고기로 확장되었습니다.. 이것은 유전자 검출에서 게놈으로 확장되었다, 염색체, 살아있는 세포에서 mRNA의 현장 검출, 및 조직 수준에서의 핵산 검출. 초기 프로브는 더 컸습니다, 벡터 증식을 통해 준비, 닉 번역, 시험 관내 전사, 및 특정 혼성화 클론을 수득하기위한 랜덤 프라이머 DNA 합성.
하지만, 큰 단편 프로브는 일반적으로 반복 서열을 포함 하였다, 높은 형광 배경을 초래합니다. 비특이적 하이브리드 화를 억제하기 위해 비특이적 부위에 결합하기 위해 사전 처리를 위해 표지되지 않은 핵산을 사용하면 이러한 문제를 극복 할 수 있습니다., 연구원들이 탐지 목표를 확장하고 전체 염색체 염색을 달성 할 수 있도록.
세포 유전학에서, 어류 기술은 염색체 분석을 크게 향상시켰다, 비교 게놈 혼성화 사용과 같은 (cgh) 염색체 영역 결실 및 복제를 감지합니다. 큰 조각 프로브, 한때 비 종교적으로 샘플에 결합되었습니다, 신호를 형성합니다, 염색체에서의 유전자 검출 혼동, 작은 조각으로 전단이 필요합니다 (<200 뉴클레오티드).
탐지 방법과 소프트웨어의 발전은 어류 탐지 요구 사항을 줄이고 민감도를 높였습니다.. 정확한 계산 이미지 처리 알고리즘은 고해상도 하부 미생물 프로브 기술을 형성했습니다..
탐지 대상이 작아지면서, 어류 기술은 숨겨진 서브 톨로메 등 핵형 유전자 재 배열 및 정확한 염색체 매핑 및 단일-코피 mRNA 검출에 사용되었습니다..
어류 탐지 범위의 확장으로 1990 년대에 어류 기술 응용 분야가 급격히 증가했습니다.. 어류 관련 분기 기술은 점점 더 많은 수의 다른 유형의 사이트를 동시에 감지 할 수있게했습니다..
처음에는, 여러 부위를 검출하기 위해 상이한 형광 단이 사용되었다, 특정 핵산 서열을 검출하기위한 이중 색 형광과 같은, 각 염색체, 유전자, 또는 전 사체는 구별 가능한 형광 신호로 표현되었다. 후속 컬러 코딩 체계는 물고기 응용 분야를 더 확장했습니다, 주로 여러 사이트를 묘사하기 위해 총 색상의 각 색상의 비율을 기준으로합니다..
이 방법, 또는 그들의 조합, 최대 감지를 가능하게했습니다 12 사이트. 컴퓨터 전환 된 5 색 체계 사용, 모든 인간 염색체는 동시에 감지 될 수 있습니다, 물고기 다중 사이트 탐지에서 이정표를 표시합니다. 다양한 방법이 mRNA를 감지 할 수 있지만, 물고기는 전체 성적표의 현장 분석에 더 유망한 것 같습니다.. 색상 코딩 기술은 전체 조직 검출을 달성했습니다.
2. 어류 기술의 정량 분석 단계
~ 안에 1986, Pinkel et al. 기본 세포 유전 학적 검출을위한 형광 이미지의 먼저 정량적 분석, 형광 신호를 감지하기 위해 듀얼 컬러 여기 블록 장치 카메라 사용. 정량 분석 기술은 곧 mRNA 검출에 적용되었습니다. 형광 검출의 주요 측면에는 신호 재현성이 포함됩니다, 무작위성, 및 배경자가 형광. 형광은 다른 샘플뿐만 아니라 동일한 슬라이드 또는 동일한 셀 내에서도 다릅니다..
일부 조직에서자가 형광을 제거하기 위해 다양한 방법이 사용됩니다., 비특이적 배경 신호를 제거하기위한 샘플 준비 동안 나트륨 붕산 나드라이트 처리 또는 광 조사 사전 처리와 같은. 이러한 방법은 완전히 효과적이지 않습니다, 따라서 계산 산술은 일반적으로자가 형광 신호를 제거하기 위해 이미지 분석 중에 사용됩니다..
형광 이미지의 스펙트럼 데이터에는 실제 신호 및 노이즈가 포함됩니다., 개별 스펙트럼 구성 요소 분석을 통해 별도로 분석 및 제거됩니다.. 다색 물고기에는 한계가 있습니다, 다양한 형광 강도와 색상 중첩을 포함합니다. 하지만, 컴퓨터 알고리즘 균형 멀티 컬러 이미지, 강도 변경 및 자동 신호 중첩 보정을 포함합니다.
어류 이미지의 한계는 자동화 된 디코딩 알고리즘의 개발을 방해하지 않았습니다.. DNA 부위 검출 및 다색 형광 계수 알고리즘에 더 큰 프로브를 사용하여 자동 분석을 달성하는 병리학자가 있습니다.. 추가적으로, 프로브 키트 응용 프로그램 및 포인트 계산 방법은 편리한 탐지 결과를위한 플랫폼을 제공했습니다..
자동화 된 셀 탐지 시스템을 분석하거나 최적화하는 데 다양한 방법이 사용되었지만, 수동 세포 병리학 적 검출은 여전히 신뢰할 수있는 조직 분석 방법으로 남아 있습니다.. 하지만, 전산화 된 세포 준비의 고효율, 신분증, 향후 의료 진단에서 고정 매체에 대한 샘플 탐지는 간과되어서는 안됩니다.. 세포 내 분자 신호의 빠른 검출은 전산화 된 방법을 통해서만 달성 될 수 있습니다.. 현재, 자동 검출 프로그램은 특정 DNA 클러스터 및 전사 부위를 탐지하기 위해 다운 전사 모델로 확장되었습니다., 세포의 기능적 상태를 결정합니다.
3. 탐지 분야에서 어류 기술 개발
프로브 유형 및 탐지 사이트에 중점을 둔 Fish의 초기 개발 고려, 형광 탐지 기술의 향후 발전에는 탐지 필드의 확장이 포함될 수 있습니다.. 형광 이미지의 임상 진단 응용은 탐지 시스템의 추가 개선이 필요합니다., 프로브 바인딩과 같은, 이미징, 자동화 된 분석, 다른 프로세스 간의 운영 오류를 피하기 위해. 샘플 두께는 형광 현미경에 의해 검출 될 수있는 샘플의 유형을 제한한다.. 최근의 레이저 공 초점 현미경 및 광학 X- 레이 단층 촬영 기술은 샘플 두께가 필요합니다. 1-2 mm. 개선 된 광학 투영 X- 선 미생물 촬영 기술은 샘플을 최대화 할 수 있습니다. 15 두께 mm, 생물학적 및 진단 샘플의 검출 범위 확장.
살아있는 세포에서 RNA를 탐지하기위한 어류 기술도보고되었습니다., 생체 내 방출 된 형광 그룹 또는 하이브리드 화 프로브 형광 검출 사용. 두 가지 새로운 방법 모두 비특이적 라벨링 된 프로브에서 높은 배경을 줄입니다. (살아있는 세포와 같은) mRNA 합성 및 전달 경로를 추적 할 수 있습니다. 이러한 방법은 녹색 형광 단백질에 비해 다른 표적 분자를 더 쉽게 감지 할 수 있습니다. (GFP). 세포에서 내부 프로브 합성에 대한 물고기의 감수성은 GFP보다 더 많은 살아있는 세포 인시 튜 하이브리드 화 검출에 영향을 미칩니다..
어류는 살아있는 유기체에서 유전자 발현을 감지 할 때 간섭 배경을 줄이고 내부 혼성화 제품의 간섭을 피하기 위해 추가 개선이 필요합니다.. 어류 및 형광 단백질 기술을 결합하여 표적 핵산 및 단백질을 동시에 감지 할 수 있습니다..
다상 현미경의 적용은 형광 이미지 응용의 범위를 더욱 확장시킵니다.. 다 광자 현미경은 레이저 블록을 사용하여 현미경에 중점을 둔 광자를 방출하여 목표 형광 단을 2 ~ 3 회. 근적외선 여기등등은 생물학적 샘플을 더 깊이 침투 할 수 있으며 가시 광선보다 살아있는 샘플에 독성이 적습니다.. 이 새로운 방법은 살아있는 시스템 감지에 형광 이미지를 적용했습니다., 심지어 전체 동물.
생물학적 마커 프로브는 아직 합성 될 수 없기 때문이다, 생체 내 형광 영상의 현재 적용은 살아있는 유기체에서 형광 분자 또는자가 형광으로 제한된다..
정상적인 생리 학적 또는 병리 생리 학적 과정에서 생물학적 조직에 의해 생성 된자가 형광 신호는 중요한 진단 신호로 작용할 수 있습니다.. 일단 생물학적 프로브가 실현 가능해진다, 특정 핵산 서열을 식별하기위한 강력한 보조 도구가 될 것입니다., 비 침습적 진단 수행, 진단 이미지를 얻습니다.
