DNA 電気泳動は、DNA 断片をサイズごとに分離するために使用される一般的な実験技術です。. 研究者が視覚化できるようになります, 識別する, 分子量に基づいて DNA サンプルを精製します.
このテクニックの背後にある原理を理解する, その主要なアプリケーション, 適切な使用法は、分子生物学で DNA 分析に取り組む人にとって不可欠です。, 法医学, 臨床診断, などなど. このガイドでは、DNA 電気泳動の包括的な概要を説明します。.
DNA電気泳動の原理は何ですか?
電気泳動による DNA 断片の分離は、電場の影響下でアガロースゲルマトリックスを通過する負に帯電した DNA 分子の移動に基づいています。.
重要な原則は次のとおりです:
- DNA分子はリン酸骨格により均一な負電荷を持っています. これは、電荷対質量比が一定であることを意味します.
- 電流を流すと, マイナスに帯電した DNA 分子は、プラスの電極に向かって引き寄せられます。.
- アガロースゲルはふるい分け効果をもたらし、小さな DNA フラグメントが大きな DNA フラグメントよりも速く移動します。.
- したがって, 時間とともに, DNA断片はサイズによって分離される, 小さな破片は大きな破片に比べて正極に近い.
アガロースゲルの仕組み?
アガロースゲルは海藻から抽出されたアガロースポリマーで構成されています. アガロース粉末を緩衝液に溶解し、放置すると、, 小さな孔を含むゲルを形成します.
アガロースゲルの特徴は次のとおりです。:
- アガロースの濃度が細孔サイズを決定します. パーセンテージが高いほど毛穴は小さくなります.
- 細孔サイズが小さいと移動が遅くなりますが、小さな DNA フラグメントの分離が向上します。. 細孔が大きいと、より速い移動が可能になりますが、解像度は低くなります。.
- ゲルは、電気泳動中に一定の pH を維持する導電性バッファーに浸されます。. 一般的なバッファは TAE と TBE です.
- エチジウムブロマイドなどの挿入色素を添加. この色素は DNA 塩基の間に挿入され、UV 光下で DNA バンドを視覚化できます。.
DNA電気泳動を実行するために必要なもの?
The 基本装備 アガロースゲル電気泳動用の材料は、:
- アガロースゲル –通常 0.5-2% アガロース濃度. パーセンテージが高いほど、小さな断片をより適切に分離できます。.
- ゲルトレイとコーム– サンプルウェルを使用してゲルをキャストするには.
- 電気泳動槽– ゲルとバッファーを収容します. 電流を流すための電極が含まれています.
- 電源 –定電流を流します, 通常50～150V.
- バッファ – ゲルを浸すには通常 TAE または TBE. 電流を流す.
- 染料の装填– ウェルにロードする前に DNA サンプルに密度と色を追加するためのグリセロールとブロモフェノール ブルーが含まれています.
- DNAはしご– 既知の大きさの DNA 断片を含む分子量マーカー. サンプルバンドのサイズを特定するために使用されます.
- 染色染料 – UV光下でDNAバンドを視覚化する臭化エチジウムまたは代替品.
DNA電気泳動の重要なステップは何ですか?
DNA 電気泳動の主な手順は次のとおりです。:
- 希望の孔径のアガロースゲルを作成し、ゲルトレイにセットします。.
- 染色色素をゲルに添加する.
- DNA ラダーとローディング色素と混合したサンプルをウェルにロードします。.
- ゲルをタンク内の電気泳動バッファーに浸します。.
- 電極を取り付けて電流を流してゲルを動かします.
- 染料フロントが適切な距離を移動したら、電流をオフにします。.
- UV 光の下で DNA バンドを視覚化し、分析のために写真に撮る.
- バンドのサイズを DNA ラダーと比較してフラグメントの長さを決定します.
- 必要に応じて、下流のアプリケーションのためにゲルから DNA バンドを切り出します.
DNA電気泳動の主な用途は何ですか?
研究全体にわたって DNA 電気泳動の重要な用途が数多くあります, 臨床診断, 法医学, そしてバイオテクノロジー:
- DNA 抽出の成功を確認するか、 PCR DNAの存在と量を可視化することによる増幅.
- PCR後のDNA断片のサイズを確認する, クローン作成, または制限ダイジェスト.
- 法医学における身元検査のための DNA プロファイルの比較.
- 遺伝子挿入の検出, 削除, または遺伝的疾患に関連する突然変異.
- 特定のサイズの DNA 断片を分離および精製します, 例えば. クローン作成用.
- バンド強度によりサンプル間の DNA の相対量を定量化.
- 拡散バンドまたは複数のバンドからの DNA 分解または汚染物質をチェックします。.
- シーケンス用の DNA を準備する, サザンブロット, または電気泳動移動度シフトアッセイ.
DNA ゲルを実行する際の重要な考慮事項は何ですか??
以下は、DNA ゲルを実行する際に留意すべき重要な考慮事項です。:
- 予想されるフラグメントサイズに適したアガロース濃度を選択してください.
- バンドサイズの識別を可能にするために、少なくとも 1 つのレーンに DNA ラダーを含めます.
- ウェルにロードする前に、サンプルをローディング色素と完全に混合します。.
- サンプルウェルに多量の DNA を入れすぎないように注意してください。.
- 適切な電圧でゲルを実行します – 電圧が高いとバンドの歪みが発生する可能性があります.
- 色素フロントが適切な距離を移動したら、電気泳動を停止します。.
- UV光でDNAを可視化する際には保護具を着用してください.
- バンドが拡散しすぎる前に素早くゲルを撮影します.
- DNAバンドを切り出す場合, フラグメントごとに UV トレイ上の清潔なメスを使用します.
結論
それで, DNA電気泳動は、電流の下でアガロースゲルマトリックスを通って帯電したDNA分子を移動させて断片をサイズごとに分離する重要な技術です。. 主な用途には PCR 産物の視覚化が含まれます, ゲノムDNAの分析, DNA 断片の分取精製. 最適な結果を得るために電気泳動を実行する際は、原理と技術的な詳細に細心の注意を払う必要があります。. 練習で, DNA電気泳動は多くの分子生物学研究室にとって信頼できる主力技術となる.
よくある質問
電気泳動はなぜ DNA をサイズごとに分離するのでしょうか?
同じ電荷密度にもかかわらず, アガロースゲル細孔のふるい効果により、DNAの摩擦がサイズに比例します – 破片が小さいほど抵抗が少なくなります. これにより、サイズに基づいた分離が行われます。.
DNA ラダーからの断片サイズの推定はどの程度正確ですか?
はしごとの比較により、バンドのサイズの概算が得られます。, 通常内 10% 正確さ. より正確なサイジングには専門的なフラグメント分析が必要です.
なぜラダーはサンプルと同じゲル上で実行されるのですか?
サンプルと一緒に DNA ラダーを実行すると、特定のゲル内の移動を視覚化し、バンド内移動の歪みを考慮することができます。.
バンド強度から直接 DNA 量を定量できますか?
相対強度は推定値を提供しますが、, 正確な DNA 定量化には、分光光度計や蛍光光度計などの特殊な機器が必要です.
なぜサクサクしているのか, DNA電気泳動で重要な明確なバンド?
鋭い DNA バンドは無傷であることを示します, 純粋な DNA 断片. 拡散したバンドやスメアは、DNA の劣化、または干渉する残りのプライマーや塩などの汚染物質を示唆しています。.
電気泳動で DNA を配列ごとに分離できるか?
いいえ, アガロースゲル電気泳動はサイズのみで分離します. しかし, DGGE のような特別な技術では、わずかな配列の違いに基づいて分離することもできます。.
