リボヌクレアーゼh, または略してRNase H, DNAにハイブリダイズしたRNA鎖のホスホジエステル結合を特異的に加水分解する不可解な能力を持つエンドリボヌクレアーゼ酵素です. その活動は矛盾しているように見えますが、, RNase H は、RNA-DNA ハイブリッドの RNA 部分を選択的に標的とすることにより、基本的な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たします。. 部位特異的な切断能力の爆発的な性質により、分子生物学技術における多用途のツールになります。.
ここでは、RNase Hが行うことを詳細に調査します, それがどのように機能するか, NEBからの組換えRNase H製品の主要な機能とアプリケーション, そして、研究者が自分のニーズに合った適切なRNaseH酵素を選択するのを助けます.
RNase Hの機能とは何ですか?
RNase Hの主な機能は、RNA-DNA二重鎖のRNA鎖を切断することです, DNA鎖をそのまま残します. この標的RNA消化は、細胞内のDNAおよびRNAトランザクション中に形成される可能性のあるRNA-DNAハイブリッド交差点を解決するのに役立ちます. RNase H活性は、DNA複製のようなさまざまなDNAおよびRNA代謝プロセスにとって重要です, 転写, 岡崎フラグメントの成熟.
RNAプライマーがDNAに持続するのを防ぎ、補完的なDNAテンプレートにハイブリダイズしたRNA転写産物を除去します. DNA部分を保護しながらRNA部分を標的にして分解するこのプロセスは、in vivoでの核酸トランザクションの促進においてRNase Hが果たす役割の中心です。.
RNase H はどのように機能し、その酵素活性は何ですか?
RNase Hは、RNA-DNAハイブリッド領域を見つけ、3つの間にホスホジエステル結合を正確に切断することにより機能します′-RNAリボースのヒドロキシル基と鎖内の次のRNAリボースのリン酸塩グループ. DNA鎖の完全性を乱すことなく、酸塩基加水分解反応を触媒します.
分子レベルで, RNaseHはRNA-DNA接合部を認識し、二重構造に強く結合します. そのアクティブサイトは、RNA鎖のホスホジエステル結合を3で1つずつ進めます′ 5に′ 方向. このプロセスは、DNAパートナーに影響を与えることなくRNAセグメント全体が分解されるまで続きます. この標的酵素活性はRNase H活性と呼ばれ、定義された条件下で特定の期間内にRNA-DNAハイブリッドで特定の量のRNAを切断するために必要なRNase Hの量として定量化されます.
NEB の RNase H 製品の主な特徴と用途は何ですか?
ニューイングランドBiolabsまたはNEBは、分子生物学用途向けの高品質の酵素の大手プロバイダーです. それらの組換えRNaseHは、いくつかの有利な特徴を備えた洗練された酵素です. 広いpHおよび温度範囲での活動をサポートするために、最適化された反応バッファーとともに供給されます. 組換え製品として, 汚染物質のないバッチ間の一貫性を提供します.
NEBのRNaseHは高いRNase H機能と特異性を示しています, DNAを乱すことなく、RNA-DNAハイブリッドのneb RNase hでRNA鎖を消化する. 逆転写のような技術のアプリケーションがあります PCR (RT-PCR) RNase H活性によるファーストストランド合成中に形成されたRNA-CDNAハイブリッドの解決に役立つ場合. NEBのサーモスタブルRNase Hは、高温核酸用途にも利用できます.
最適なRNase H活性に必要な条件とバッファー?
最適なRNase H活性用, NEBの組換えRNase Hには、特定の反応条件とバッファー成分が必要です. 供給された10x RNase H反応バッファーは構成されています Tris-HCl, KCL, MGCL2, 最大酵素機能のために正しいイオン強度とpHを維持するDTT. RNase HはpHで最適に機能します 8.3 および37°C. バッファーにMg2+イオンを含めることは重要です。RNaseH機能は、その触媒活性についてMg2+に依存するため重要です。.
DTTは、酵素を酸化から保護する還元剤として機能します. RNase H酵素を組み合わせることにより、反応が設定されます, 基質RNA-DNAハイブリッドと1倍の濃度でのバッファー. 適切なバッファリングにより、RNase Hの安定性とハイブリッドからのRNA部分の一貫した切断が向上します.
RNase Hが作用する核酸と作用しない核酸の種類は何ですか?
ただし、RNase HはRNA-DNA二重鎖のRNAを選択的に標的とします, 一本鎖RNAまたはDNAを消化しません. また、二本鎖DNAを切断しません. その正確な酵素RNaseH活性は、DNA鎖にハイブリダイズされたRNAに特異的です. 酵素は、DNAパートナーの完全性と連続性を乱すことなく、RNA-DNAヘテロドゥプレックスのRNA部分を効率的に識別および分解します.
RNase Hは、RNA-DNA接合部を欠く二本鎖DNA分子または二本鎖DNA分子ではほとんどまたはまったく活性を示しません。. この厳しい基質特異性により、さまざまな核酸トランザクションに不可欠なハイブリッド複合体からの制御および標的RNA除去が可能になります.
NEBの組換えRNase Hのソースと生産方法は何ですか?
NEBのRNaseHは、バッチ間の高い純度と一貫性のためにE.coliで組換え産生されます. クローニング源は、大腸菌から分離されたネイティブRNase H遺伝子であり、E.coli細胞に存在する内因性RNase Hをコードします. この遺伝子は発現ベクターに挿入され、非病原性E.coli株で増幅されます. ベクターの誘導は、高レベルの組換えRNase Hタンパク質発現につながります.
次に、過剰発現したRNase Hをカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、汚染ヌクレアーゼのない高度に精製された準備を得る. 品質管理チェックは組換え酵素を認定. 最終製品は、その機能に最適化された反応バッファーとともに提供されます.
NEBのRNaseHは、RT-PCRのような分子生物学技術でどのように使用されていますか?
RNase Hの重要な用途の1つは、逆転写PCRにあります (RT-PCR) 最初の鎖の間に形成されたRNA-CDNAハイブリッドの解決に役立ちます cDNA合成. RT-PCRで, RNAテンプレートは、最初にその相補的なDNAに逆転写されます (cDNA) DNAプライマーを使用します. このプロセスは、RNA-CDNAハイブリッド二重鎖をもたらします. 次に、NEBの組換えRNase Hを使用して、これらのハイブリッドのRNA鎖を選択的に分解し、一本鎖cDNAのみを残します.
元のRNAテンプレートを分解すると、その後のPCR増幅に干渉することができなくなります. RNAを効果的に切断することにより, RNase Hは、cDNAのみの指数増幅を可能にして、特定のRNA転写産物を検出および分析します. 最適化された条件下での分解ハイブリダイズRNAの精度と効率は、RT-PCR分析の品質と感度を高めます.
NEBのRNaseHの温度範囲と熱の不活性化ポイントは何ですか?
NEBからの通常のRNase Hは25〜42°Cの間でアクティブで、最大活動は37°C前後. 65°Cに加熱すると、不可逆的に不活性化されます 20 分. より高い温度を必要とするアプリケーションの場合, NEBは、RNase Hのサーモスタブルバリアントも提供しています. この熱耐性RNase Hは、25〜80°Cの間に完全に機能し、高温で50〜60°Cまでの活動が増加しています。.
80°Cに加熱した後でも安定したままです, より高い熱サイクリング条件で実行される核酸技術を要求するのに適しています. サーモスタブルRNase Hは、不活性化のステップとプロテイナーゼK治療に耐えることができます, より柔軟性を提供します. 両方のRNaseHバージョンは、効果的な使用のために広範な製品ドキュメントとともに提供されます.
NEBから通常とサーモスタブルRNase Hを選択する方法?
通常とサーモ安定性のRNaseHの選択は、温度要件とワークフローに依存します. 通常のRNase Hは、反応を42°C未満で実行できる場合、費用対効果の高いオプションです。, 標準のRT-PCRのように. サーモスタブルRNase Hは、ネストされたPCRのように50〜80°Cの高さの熱サイクルを含む技術の利点を提供します, 逆転写ループを介した等温増幅 (rt-lamp), その他のサーマルプロファイリングアプリケーション. その熱耐性特性は、複数の暖房ステップ中に活動の損失を防ぎます.
高温核酸分析を実行する研究者は、サーモスタブルRNase Hの拡張機能範囲と耐久性の恩恵を受ける. 全体, NEBの組換えRNase H酵素は、広範囲の用途にわたってRNA-DNA複合体で制御されたRNA消化に信頼できるツールを提供します.
まとめ
結論は, このブログ投稿は、RNase Hが何であるかを包括的に説明することを目的としています, それが具体的に機能する方法, NEBの組換えRNase H製品の重要な属性, 最適な反応条件, RT-PCRなどの手法のアプリケーション, および適切な RNase H 酵素を選択するための考慮事項.
その興味深い酵素活性と標的RNA切断能力をシンプルかつ詳細な方法で掘り下げることにより、, これが、多用途の RNase H と核酸取引におけるその重要な役割にさらに光を当てるのに役立つことを願っています. 他にさらに説明が必要な点がある場合はお知らせください.
