分子生物学技術の発展により, 遺伝子の構造や変異を検出するためのさまざまな方法が継続的に登場しています. 特に登場してからは、 PCR テクノロジー, PCRと組み合わせたさまざまな遺伝子検出技術が遺伝子研究の進歩をさらに推進. 非対称 PCR 産物のダイレクトシーケンスなどの技術, リボヌクレアーゼ切断 (Rベスト), および制限断片長多型解析 (RFLP) 遺伝子解析の強力なツールとなっている. しかし, これらの方法は操作が比較的面倒です, 重大な制限がある, または高度な実験条件が必要です, 一般の臨床検査室には不向きです.
で紹介されました 1989, PCR-SSCP (一本鎖立体構造多型) 継続的な改善と改良が行われてきました, よりシンプルにする, もっと早く, 遺伝子変異を検出するためのより高感度な方法. 点突然変異や短い配列の欠失や挿入の検出に使用されるだけでなく、DNA の定量化にも適用されます。, PCR診断実験における相互汚染のモニタリング, そして感染源を調査する. SSCP の優れた利点により, 近年広く適用されています.
SSCPの原理と特徴
- 発見と基本的な概念:
- 一本鎖DNA (ssdna) 断片は、分子内相互作用によって維持される複雑な空間折りたたみ立体構造を示します, 主にベースペアリング.
- 単一のベースの変更は、空間立体構造を大幅にまたはわずかに変更できます, ポリアクリルアミドゲルの移動パターンが異なります.
- 分離メカニズム:
- 非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) ゲル内の閉塞のレベルがさまざまなレベルであるため、異なる立体構造でssDNA分子を鋭く分離できます.
- SSCP分析:
- 一本鎖立体構造多型と名付けられました (SSCP) 日本の研究者オリタと同僚によって.
- PCR増幅産物の遺伝子変異を検出するために適用されます, シンプルさと感度を高める.
- 基本プロセス:
- PCR増幅: ターゲットDNAを増幅します.
- 変性と再生: 特定のPCR産物を変性し、それらを急速に再現して、特定の空間構造で一本鎖DNA分子を形成する.
- 非変性ページ: 適切な量の一本鎖DNAで非変異ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実行する.
- 検出: X線撮影のオートラジオグラフィーを使用して結果を分析します, 銀染色, または臭化エチジウム染色.
- 解釈:
- 通常の制御と比較したssDNAの移動速度の変化は、立体構造の変化を示しています, そのDNAフラグメントの塩基突然変異を示唆しています.
- 利点:
- 単純, 速い, および敏感な方法.
- 特殊な機器は必要ありません.
- 臨床研究所に適しています.
- 制限事項:
- 突然変異のみを検出します; 突然変異の正確な位置とタイプを特定するには、さらなるシーケンスが必要です.
- 厳密な電気泳動条件が必要です.
- ポイント変異がssDNAの立体構造を有意に変化させない場合、または他の条件が干渉した場合の可能な偽陰性.
- 検出効率:
- 制限にもかかわらず, SSCPは、他の方法と比較して高い検出率を誇っています.
- ターゲットDNAフラグメント内で未知の塩基変異を識別できる.
- タカオは、SSCPが検出できることを実証しました 90% より短いDNAフラグメントのシングルベース変異の 300 血圧.
- さらなるアプリケーション:
- SSCPは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を介して異なる移動速度で変異体SSDNAを分離できます.
- シーケンスレベルでの変異DNAフラグメントのさらなる精製と識別を可能にします.
SSCPの開発と改善
- 初期開発:
- 最初は, SSCPには、同位体をPCR増幅産物に組み込むことが含まれていました, 結果はオートラジオグラフィーを通じて表示されました. これは、広範囲にわたる採用の課題をもたらしました.
- 簡素化:
- DNA銀染色とPCR-SSCPの組み合わせ, 特に臭化エチジウム直接染色の適用, 方法を大幅に簡素化しました.
- 最近の注目すべき改善点:
- RNA-SSCP分析:
- 基本原則: RNA はより複雑な二次および三次構造を持っています, 一塩基変異に対する感受性が非常に高い, したがって、検出率が向上します.
- 変異検出率は次を超える可能性があります 90%.
- RNAは二本鎖を形成しにくい, 電気泳動でより大量に使用できるようになります。, これは臭化エチジウム染色に有益です.
- しかし, この方法では逆転写ステップが追加され、RNA ポリメラーゼ プロモーター配列を含むより長いプライマーが必要になります。, 複雑さが増す.
- RNA-SSCP分析:
- SSCP と他の突然変異検出方法の組み合わせ:
- ヘテロ二本鎖分析 (それ):
- SSCPと組み合わせると検出率が大幅に向上します.
- プローブとターゲット ssDNA または RNA のハイブリダイゼーションが含まれます。. 非変性 PAG ゲルでの電気泳動により、ミスマッチ塩基対を含むハイブリッド鎖を完全に相補的なハイブリッド鎖から分離できます。.
- 同じターゲット配列に対して SSCP 分析と Het 分析の両方を実行すると、ほぼ同じ結果を達成できます。 100% 点突然変異の検出率, 実験のシンプルさを維持しながら.
- ヘテロ二本鎖分析 (それ):
PCR-SSCPの手順
DNA断片の長さに基づいたゲルの調製
1Kb未満のDNA断片の場合, ポリアクリルアミドゲルの濃度は次のように選択します。:
- DNA断片の長さ (血圧): % アクリルアミド濃度
- 1Kb-700b: 3.5%
- 700b–500b: 5%
- 500B-200B: 8%
- 200b: 12%
SSCP 前の準備
- PCR増幅: スメアリングを最小限に抑えながら特定の産物を増幅する (アガロースゲル電気泳動により確認).
1. ポリアクリルアミドゲルの調製 (パグ)
- 上の表から必要な濃度に基づいてゲル溶液を調製します。.
- ゲル型にコームを差し込みます.
- コームの一方の端からジェル溶液を注ぎます, ゲルが櫛の歯に到達するときに、泡の形成を防ぐために型を注ぎ端に向かって傾けます。.
- ゲルを室温で固まらせる 1 時間.
- コームを取り外し、1×TBE バッファーをゲルの上に加えてカバーします。.
2. 電気泳動
- 取る 10 PCR産物 μl.
- 追加 10 変性剤 μl (95% ホルムアミド, 10 mmol/L EDTA, 0.02% ブロモフェノールブルー).
- 追加 30 ミネラルオイル μl.
- 煮る 5 分, その後、すぐに少なくとも氷浴に入れてください。 2 分.
- 水相全体をゲルにロードします.
- 10～15℃で電気泳動を行ってください。:
- 300Vから始めてください。 5 分.
- 120V を継続します。 8 時間.
- 電気泳動後, を含む1×TBEバッファーでゲルを染色します。 0.5 μg/ml臭化エチジウム 30-45 分.
- UVライトの下で観察するか、銀染色に進みます。.
3. シルバー染色
- PAG を脱イオン水で 2 回洗浄します。.
- ゲルを次の溶液で固定します。 10% エタノールと 0.5% 酢酸 6 分.
- 脱イオン水で 2 回洗浄します.
- 浸る 0.2% 硝酸銀 (硝酸銀) のソリューション 10 分.
- ウォッシュ 3-5 脱イオン水で時間.
- の解で発達します 1.5% 水酸化ナトリウム (ナオ) そして 0.4% ホルムアルデヒドの 7 分.
- 開発を停止します 0.75% 炭酸ナトリウム (Naco3).
SSCPの応用例
Oritaと同僚はヒトDNA多型分析にSSCPを使用したため, この方法は、さまざまな分野で広く採用されています, 癌および遺伝性疾患に関連する遺伝子変異の検出を含む, ウイルスのタイピングおよび汚染モニタリングと同様に.
がん遺伝子変異の検出
- 腫瘍関連変異:
- SSCPは、星状細胞腫などのさまざまな癌に関連する遺伝子の変異を検出するために広く使用されています, 脳腫瘍, 小細胞肺癌, 胃癌, および結腸直腸癌.
- これらの腫瘍のp53遺伝子の変異と肺がんのRAS遺伝子変異を検出するために適用されています.
- 成功したアプリケーション:
- 最近, Sugano et al. 銀染色されたSSCPを正常に使用して、位置で突然変異を検出します 12 c-ki-ras2遺伝子の, 内部の電気泳動と染色プロセスを完了する 2.5 時間.
遺伝性疾患の研究
- SSCPは、遺伝性疾患に関与する遺伝子の研究で使用されます:
- 嚢胞性線維症: CFTR遺伝子の変異の検出.
- 神経線維腫症タイプ 1: 遺伝子変異の分析.
- 家族性腺腫性ポリポーシス: この状態に関連する遺伝子研究.
- RNA-SSCP対. DNA-SSCP:
- Sharkar et al. RNA-SSCPを使用して遺伝子配列を検出しました 28 血友病B患者.
- DNA-SSCPおよび直接遺伝子シーケンスとの比較が明らかになりました 20 2.6kb因子IX遺伝子の塩基変異, RNA-SSCP検出で 70% と比較したこれらの変異の 35% DNA-SSCPによって検出されました, RNA-SSCPのより高い感度を実証します.
ウイルスの型別と汚染の監視
- ウイルスタイピング:
- SSCPは、PCR実験におけるウイルスのタイピングと監視汚染に使用されます.
- YAPはネストされたPCRを使用して、さまざまな地域からのHBVサンプルを検出しました, 続いてSSCP分析, 各サンプルの異なるSSCPパターンが明らかになりました, HBV DNAの地域の変動を示し、相互汚染の可能性を排除する.
- 汚染モニタリング:
- SSCPは、PCR診断結果の精度を確保するための信頼できる方法として機能します.
病原体伝播研究
- SSCPは、病原体の伝達経路を研究するために利用されています.
定量的DNA分析
- 乳がん細胞分析:
- SSCP, 競争力のあるPCRと組み合わせて, 乳がん細胞における変異P53遺伝子の定量分析に使用されました.
- この方法の利点は、ターゲットDNAとは1つのベースのみによって異なる内部標準の使用にあります, 同一の増幅条件を確保し、したがってより正確なDNA定量化.
SSCPに関する注意事項
SSCPは急速です, 単純, 遺伝子変異を検出するための敏感な方法. 最適な結果を達成するため, 次の予防措置を遵守する必要があります:
再現性:
- SSCPの再現性に影響を与える主な要因は、電気泳動電圧と温度です. これらの条件を一定に保つことで、SSCPパターンの良好な再現性が保証されます.
- 一般的に, SSCPパターンは、2つの一本鎖DNAバンドを示しています, しかし、2つの一本鎖DNA分子間の同様の空間立体構造のために、3つまたはそれ以上のバンドのみが現れることがあります. 3つ以上のバンドの存在は、野生型と変異体DNAフラグメントの混合を示すことができます.
ターゲット DNA 配列長の影響:
- SSCPは、長いDNAまたはRNA配列の点変異を長いものよりも検出するのに効果的です. これは、より長い分子の単一塩基の変化が空間立体構造の維持に影響を与えるためである可能性があります.
- 一部の研究者は、DNA鎖についてより短いと考えています 400 血圧, 長さはSSCPの有効性に影響しません. 実験的条件を慎重に選択すると、検出率が達成される可能性があります 90% ポイント変異の場合 354 BP DNAフラグメント.
電気泳動の電圧と温度:
- 一本鎖DNAの安定した空間立体構造を維持するため, SSCPは低温で実施する必要があります (通常、4°Cから15°Cの間). 開始時の高電圧 (250V) のために 5 議事録は、ゲル温度を大幅に上げることなく、異なる立体構造で一本鎖DNAを最初に分離するのに役立ちます. これに続いて、より低い電圧が続く必要があります (約100V) ストランドをさらに分離します.
- 電気泳動の正確な電圧は、特定の実験条件に基づいて決定する必要があります.
点突然変異の位置の影響:
- DNAまたはRNAの点突然変異の位置は、空間立体構造の維持におけるその役割に基づいてSSCP検出率に影響します, チェーン上の線形位置ではなく.
- DNAの中央領域の変異は、一般に、端近くのものと比較して検出が簡単です.
- しかし, 中央地域の変異でさえ、空間的立体構造を大幅に変えないと検出されない可能性があります. 例えば, ホワイトの研究ではそれだけが見つかりました 2 のうち 9 ヘアピン構造のループに点変異があるサンプルが検出されました, の検出率を示します 22%.
SSCP 結果の解釈:
- SSCPは、分子量や電荷ではなく、空間立体構造に基づいて一本鎖DNAを分離します. 時々, 正常鎖と変異鎖の移動率は非常に近い, それらを区別するのを難しくします.
- 通常, の電気泳動長 16-18 CMは、検出限界に基づいて結果を正確に決定する必要があります, これは、変異体と正常なDNAフラグメントの間の最小の識別可能な電気泳動距離の距離の差です.
- 距離が検出限界より大きい場合 (例えば, 3んん), 突然変異が示されています. 距離が小さいと変化がないことが示唆されます. 低い検出限界を設定すると、誤検知が誤ってつながる可能性があります.
- その他の条件, ロードされたPCR製品の量など, PAG架橋の程度, およびゲル濃度, 特定の実験要件に基づいて選択する必要があります.
PCR-SSCPのステップ別詳細
サンプルの準備
- PCR増幅と検出:
- 適切なプライマーを使用してPCR増幅を実行し、適切なアニーリング温度を選択します.
- 増幅製品をaで実行して検出します 2-2.5% 水平電気泳動を通るアガロースゲル. 負荷 3-5 PCR製品のµL.
- PCR産物の最適な濃度は周りにあるはずです 10 ng/µl.
- PCR産物と変性バッファーを混合します:
- 追加 5 SSCPサンプルバッファーのµL (変性バッファー, シーケンスバッファーと同じ “分子クローニング”) きれいなPCRチューブの底に.
- PCR増幅製品をバッファーの中心に追加します. アガロースジェルのバンドの可視性に基づいて量を調整します:
- バンドが明るい場合, 追加 1 μl.
- 結果が優れている場合, 追加 0.5 μl.
- バンドがあまり明確でない場合, 追加 1.5, 2, または 3 µlそれに応じて.
- サンプルバッファーの量を比例して増やします, 例えば, のために 3 µLのPCR産物, 追加 8 より良い変性のためのµLのバッファー.
- PCR産物の変性:
- チューブを遠心にして、サンプルを底に集中させる.
- 95°Cでサンプルを変換します 10 を使用して議事録 PCR装置, その後、すぐにPCR製品を氷の上に置きます 5 再生を防ぐための議事録.
注記: ステップ 3 そして 4 ゲルが固化するのを待っている間、ゲル準備の4番目のステップの後に実行できます.
ゲルの準備
- ガラス板の準備:
- ガラス板の各ペアを水道水ですすぎ、それに続いてDDH2O.
- ガラス板を吸収紙で乾燥させ、無水エタノールで拭いてください.
- エタノールを蒸発させます 2-3 分.
- ガラス板を組み立てて、ゲルキャスティングスタンドに入れます, 両側と底部が確実に固定されていることを確認します.
- アセンブリネジを締めて、プレートレベルを維持します. (無水エタノールを使用して漏れを確認してください。)
大きなゲル (50% グリセロール濃度)
| 成分 | 8% ゲル (10ml下部ゲル) | 8% ゲル (5MLスタッキングジェル) | 6% ゲル (10ml下部ゲル) | 6% ゲル (5MLスタッキングジェル) |
|---|---|---|---|---|
| 30% ページ | 2.7ミリリットル | 1ミリリットル | ||
| 10×tbe | 1ミリリットル | 0.5ミリリットル | ||
| 50% グリセロール | 1ミリリットル | 0.5ミリリットル | ||
| DDH2O | 5ミリリットル | 3ミリリットル | ||
| APS | 70μl | 70μl | ||
| 激しい | 12μl | 8μl | ||
| 総量 | 10ミリリットル | 5ミリリットル |
小さなゲル (50% グリセロール濃度)
| 成分 | 8% ゲル (15ml下部ゲル) | 8% ゲル (10MLスタッキングジェル) | 6% ゲル (15ml下部ゲル) | 6% ゲル (10MLスタッキングジェル) |
|---|---|---|---|---|
| 30% ページ (4℃) | 4.05ミリリットル | 2ミリリットル | 2ミリリットル | |
| 10×tbe | 1.5ミリリットル | 1ミリリットル | 1ミリリットル | |
| 50% グリセロール | 1.5ミリリットル | 1ミリリットル | 1ミリリットル | |
| DDH2O | 7.5ミリリットル | 6ミリリットル | 6ミリリットル | |
| APS | 105μl | 70μl | 70μl | |
| 激しい | 12μl | 12μl | 12μl | |
| 総量 | 15ミリリットル | 10ミリリットル | 10ミリリットル | 5ミリリットル |
ジェル注入
- ゲルを混ぜます: 提供された定式化に従ってゲル溶液を準備した後, 均一性を確保するために徹底的に混ぜます.
- ガラス板に注ぐ: 調製したジェル溶液を組み立てたガラス板に慎重に注ぎます. 注ぎのプロセス中に気泡が閉じ込められていないことを確認してください. 気泡が観察された場合, 泡が表面に上がるようにプレートを優しく傾けて. プレートの側面を軽くタップすると、閉じ込められた気泡の放出に役立ちます.
- 櫛の挿入: ゲル溶液レベルがガラス板の上端から約0.5cm下に達すると, コームをゲルに挿入します. 櫛の歯とジェル表面の間に閉じ込められた気泡がないことを確認してください. 泡が存在する場合, 櫛を取り外します, バブルを解放します, 櫛を注意深く再挿入します.
- ゲル重合を可能にします: 櫛を挿入した後, プレートを平らまたはわずかな角度で配置することにより、ゲルを重合させる (未満 10 学位) ほぼ約レベルの表面に 30 分. この間, ゲルは重合して固化します.
注記: これはまた、ステップで説明されているように、PCRサンプルの変性を進めるのに適した時間です 3 そして 4 最初のセクションの.
ゲルの装填
- ゲルを配置します:
- 重合後にすぐにゲルから櫛を取り外します.
- 井戸の完全性を維持するために偶数力が適用されることを確認してください.
- ゲルプレートを電気泳動装置に固定し、井戸側が内側に向いています.
- 大きな空気の泡を避けるために、ゲルプレートを電気泳動緩衝液にゆっくりと遷移させます.
- エレクトロポート化前:
- 液体レベルがガラス板の短い端から約1cm上になるまで、1×tbe電気泳動バッファーを上部貯水池に追加します.
- 上部貯水池からの漏れがないことを確認してください.
- 大きな装置では電圧を140-150Vに設定し、小さな装置では110-120Vに設定します.
- ほぼ約電気泳動 10 分.
- サンプルの読み込み:
- マイクロシリンジを使用して、準備サンプルをゲルのウェルに順次追加します.
- 各ジェルプレートの端に最も近い2つのウェルにサンプルをロードしないでください.
- 電気泳動:
- 大きな装置では電圧を140-150Vに設定し、小さな装置では110-120Vに設定します.
- 最小限の10〜15°Cの温度で電気泳動を実行する 10 時間.
染色
- 固定:
- 装置からゲルを取り外します, 出発点をマークします, そしてそれを浸します 70% のためのエタノール 15 シェーカーの数分.
- 固定後にエタノールを回収し、蒸留水で2回洗い流します 3 すすぎあたりの分.
- 染色:
- 染色溶液中のゲルを染色します (200ML含有 3.6% NAOH 4.2ml, 20% AGNO3 3.6ml, アンモニア2ml) のために 30 分.
- 2つのゲルを同時に染色する場合は、染色時間を調整します.
- 現像:
- 開発ソリューションのゲルを開発します (200ML含有 1% クエン酸ナトリウム1ml, ホルムアルデヒド100ul) バンドがはっきりと見えるようになるまで.
- 蒸留水で3回洗い流します 3 開発を停止するためにそれぞれ数分.
- または、または, 0.5ug/mlの臭化エチジウムを含む1×tbeバッファーに浸すことにより、ゲルを染色します 10 数分と紫外線の下で視覚化します
数式
10×TBE式:
- トリスベース: 108g
- ホウ酸: 55g
- 0.5mol/l edta (pH 8.0), ボリュームは1Lに調整されています
変性緩衝液の配合:
- 98% 脱イオン化されたホルモアミド
- 10mmol/L EDTA (pH 8.0)
- 0.025% キシレンシアノールff
- 0.025% ブロモフェノールブルー
ノート:
- 再現性:
- 電気泳動中に安定した電圧と温度を維持することが、SSCPの再現性に影響を与える主な要因です.
- 通常, SSCPパターンは、2つの一本鎖DNAバンドを示しています, しかし、時には1つまたは3つ以上のバンドだけが表示される可能性があります, おそらく、野生型と変異体DNA断片の間に同様の3次元の立体構造が存在するため.
- ターゲットDNA配列長の影響:
- SSCPは、長鎖DNAと比較して、短鎖DNAまたはRNAの点変異の検出率が高くなります. これは、長鎖 DNA および RNA 分子の個々の塩基の変化が三次元立体構造の維持に及ぼす影響が小さいためと考えられます。.
- DNA鎖が短い場合 (400bp未満), DNAの長さはSSCPの有効性に影響を与えません.
- 電気泳動の電圧と温度の影響:
- 一本鎖DNAの安定した三次元立体構造を維持するため, SSCP はより低い温度で実行する必要があります (一般に4℃から15℃の間).
- 電気泳動中, 過剰な電圧は温度上昇を引き起こす可能性があります. したがって, 冷却装置のない電気泳動槽でSSCPを行う場合, より高い電圧 (250V) 最初に使用する必要があります, その後、約 100V に下げて電気泳動を行います。.
- SSCP 結果の解釈:
- SSCP解析では, 一本鎖DNAフラグメントの分離は、分子量ではなく、それらの立体障害のサイズに基づいています, したがって、分子量を反映することができません.
- 結果の解釈は、検出限界に基づいている必要があります, これは、変異体と通常のDNAフラグメント間の電気泳動距離の最小差を指します。.
- その他の考慮事項:
- ロードされたPCR製品の量などの条件, ポリアクリルアミドゲルの架橋密度, ゲルの濃度は、特定の実験条件に基づいて選択して決定する必要があります.
