AFLPとは? 完全な原理と運用プロセス

導入

• AFLP は、制限エンドヌクレアーゼによって生成される断片の長さを制限することによって DNA 多型を検出する DNA 分子マーカー技術です.
• AFLP 手法の主な特徴は次のとおりです。:
  • 分析には少量の DNA が必要です, わずか0.5g.
  • 良好な再現性を発揮します.
  • 強力なポリモーフィズムを示します.
  • 高解像度を提供します.
  • サザンハイブリダイゼーションを必要としない.
  • 幅広いサンプルに適しています.
  • 安定した遺伝を示す.
• 技術的な特徴としては, AFLPはRAPDとRFLPを組み合わせた製品です.
• RFLP技術の複雑さと放射性物質の危険性という欠点を克服します。, RAPD における遺伝マーカーの不安定性と優勢性、および両方の長所を組み込んでいます。.
• 近年では, この技術は継続的に改善および開発されています, AFLP を急速にこれまでで最も効果的な分子法にする.

AFLPの原理

• AFLP は、制限エンドヌクレアーゼによって生成される断片の長さを制限することによって DNA 多型を検出する DNA 分子マーカー技術でもあります。.
• しかし, AFLP には、酵素で切断されたフラグメントの増幅が含まれます。 PCR 最初の反応, 次に、増幅された酵素切断フラグメントを高分解能シーケンシングゲルで電気泳動します。. 増幅断片の長さの違いから多型を検出.
• 実験では, 酵素で切断されたフラグメントは、まず互換性のある付着末端を含む人工アダプターにライゲーションされます。. これらの凝集末端のシーケンス, アダプター配列とともに, その後の PCR 反応の結合部位として機能します。.
• 要件に応じて, さまざまなプライマー 1 に 3 末端に追加された選択的ヌクレオチドを使用して、選択的増幅を達成できます。. これらの選択的ヌクレオチドにより、プライマーは特定のペアリング配列を持つ酵素切断フラグメントを選択的に認識できるようになります。, 特定の増幅につながる.

検査に使用した試薬

実験手順

1. ゲノム DNA の抽出と精製

DNA抽出方法を参照.

DNA精製:

• DNA 断片の電気泳動 0.8% アガロースゲル (0.5μg/ml臭化エチジウム含有, eb), テイクアウト 1/3 抽出されたゲノム DNA の精製.
• まず最初に, 抽出された DNA の量を TE バッファーで総量まで補充します。 50 μl.
• フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールで1回抽出 (25:24:1) クロロホルム/イソアミルアルコールで1回 (24:1). 遠心分離し、上清をエッペンドルフチューブに移します。.
• 追加 1/10 NaAc の体積と予冷した無水エタノールの 2 倍の体積, -20°C で少なくとも 2 時間. 10,000gで遠心分離 10 分.
• DNA 沈殿物を次の方法で 2 回洗浄します。 70% エタノール, 自然乾燥, そして溶けて 30 μl TEバッファー.
• UV-2401PCを使用してA260とA280の値を測定 (Shimadzu) 定量用紫外分光光度計.
• DNA 断片の電気泳動 0.8% アガロースゲル (0.5μg/ml EB含有) サイズ決定用.

注記:

• 0.1～0.2gの組織用, 100μlの溶液Eに溶解します. 0.5gティッシュの場合, 溶液Eを300μlに増やす. この時点で, DNA濃度は約100ng/μlです.

2. 制限酵素による消化とライゲーション

0.2ml遠心管内, 追加:

• 約250ngのテンプレートDNA,
• 2.510×制限酵素消化バッファー μl,
• 2.510×T4 DNAリガーゼバッファーμl,
• 5 EcoRIの単位,
• 5 MseIの単位,
• 2 T4 DNA リガーゼの単位,
• 50pmol MseI アダプター,
• 再蒸留水を合計25μlにする.

37℃に設定した PCR サーモサイクラー内で混合物を一晩インキュベートします. 消化後, 65°C で 1 分間インキュベートして酵素を不活化します。 20 分. プレ増幅テンプレートとしてさらに使用するために、反応液を -20°C で保存します。.

3. 前置増幅

酵素消化されライゲーションされた生成物を 3μl 取り、加えます。:

• 75e+a プライマーの,
• 75m+c プライマーの,
• 15mM Mg2+,
• 25mM dNTP,
• 1 の単位 Taq ポリメラーゼ,
• 310× PCR バッファー μl,
• 再蒸留水を加えて総量を 30μl にします.

PCR 反応パラメータを次のように設定します。:

• 94℃での初期変性 90 秒,
• 94°Cでの変性 30 秒,
• 56℃でアニーリング 1 分,
• 72℃での伸長 1 分,
• 上記の手順を繰り返します 30 サイクル,
• 72℃で最終伸長 10 分 (を使用して PCR装置 PE会社から).

反応の後, 電気泳動による増幅産物の分析 0.8% アガロースゲル (0.5μg/ml EB含有). 製品を3μl採取し、希釈してください。 50 選択的増幅のテンプレートとしてさらに使用できる回数.

4. 選択的 PCR 増幅

希釈した製品を 3μl 取り、加えます。:

• 75ecorⅰ 選択的プライマーの,
• 75mseⅰ 選択的プライマーの,
• 15mM Mg2+,
• 25mM dNTP,
• 1 Taq ポリメラーゼの単位,
• 310× PCR バッファー μl,
• 再蒸留水を加えて総量を 30μl にします.

PCR 反応パラメータを次のように設定します。:

• 94℃での初期変性 90 秒,
• 94°Cでの変性 30 秒,
• 65℃でアニーリング 1 分, それから実行します 13 サイクル (サイクルごとに温度を 0.7°C 下げる),
• 94°Cでの変性 30 秒,
• 56℃でアニーリング 1 分,
• 72℃での伸長 1 分, それから実行します 25 サイクル,
• 72℃で最終伸長 5 分 (PE社のPCR装置を使用).

初め, 電気泳動による選択的増幅の産物を分析します。 0.8% アガロースゲル (0.5μg/ml EB含有).

5. ゲル電気泳動

を使用して増幅産物を分離します。 6% 変性ポリアクリルアミドゲル (0.5厚さmm) および 1× TBE 電気泳動バッファー (BIO-RAD シーケンシング電気泳動装置).

• コームを取り外し、140W の一定出力でゲルをプレランします。 30 温度が47～49℃に達するまで数分. 各ウェルから尿素を必ず洗い流してください.
• 選択的増幅産物の場合, 同量のローディングバッファを追加します (98% ホルムアミド, 10mM EDTA, 0.25% キシレンシアノール, 0.25% ブロモフェノールブルー) 94°Cで変性します。 5 分 (PE社のPCR装置を使用). 変性後, 積み込むまですぐに氷の上に置きます.
• 各サンプル 8μl を各レーンにロードします. 最初は, 100Wの一定出力でゲルを約1分間実行します。 2 ウェルの底にあるサンプルを迅速に濃縮するのに数分かかります. 次に、60Wの一定電力に調整します。, 温度を約43℃に保つ, ブロモフェノールブルーが約30％になるまで 2/3 ゲルの上部からガラスプレートまでの距離. 電気泳動を終了する.

6. シルバー染色

• 固定液: 100mlの氷酢酸を900mlの脱イオン水または再蒸留水に加えます。.
• 染色液: 1gのAgNO3を1Lの脱イオン水に溶解します, それから追加します 1.5 ml 37% ホルムアルデヒド.
• ソリューションの開発: Na2CO3 30gを溶かす, 1.5 ml 37% ホルムアルデヒド, 1L の脱イオン水に 2mg のチオ硫酸ナトリウムを溶解.

1. 電気泳動後, 銀染色用のプラスチックトレイにゲルの入ったガラスプレートを置きます。.
2. 固定: 固定溶液を加え、シェーカーで軽く振ります。 30 分. 固定後は固定液を保存しておきます.
3. すすぎ: ゲルを脱イオン水で 3 回洗浄します。 2 毎回数分.
4. 染色: ゲルを染色トレイに置き、染色液を注ぎます (4℃に保った). シェーカーで軽く振ります 30 分. ゲルを脱イオン水ですすいだ後、 10 秒, 現像トレイに移します.
5. 発達: 現像液を加える (4℃に保った) バンドの増加が止まるまで軽く振ります.
6. 終了: 使用済みの固定液をステップから追加します。 2 そして数分間かき混ぜます. 最適な結果が得られたら、蒸留水で数分間洗い流してください。.
7. ゲルとガラス板の水滴を取り除いた後, ライトボックスの上に置き、ニコンのデジタルカメラで撮影.

まとめ

完全なAFLP実験手順を提供していただきありがとうございます! ご質問がある場合、またはさらにサポートが必要な場合は, お気軽にお問い合わせください. 喜んでサポートと回答を提供いたします.