ソーラーバイオ還元型グルタチオン (GSH) コンテンツアッセイキット

還元型グルタチオン (GSH) コンテンツアッセイキット

注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.

操作装置: 分光光度計/マイクロプレートリーダー

カタログ番号: BC1175

サイズ: 100T/96S

コンポーネント:

試薬I: 100 mL×1. 4℃で保存.

試薬II: 20 mL×1. 4℃で保存.

試薬Ⅲ: 8 mL×1. 4℃で保存, 光から守る.

標準: 粉 10 mg×1. 4℃で保存, 光から守る.

製品説明

グルタチオンはグルタミン酸から構成される天然のトリペプチドです (グル), システイン (シシス) とグリシン (グライ). スルフヒドリル基を含む化合物の一種です (-SH), 動物組織に広く存在する, 植物組織, 微生物, そして酵母. グルタチオンは5,5と反応することができます′-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸) (DTNB) 2-ニトロ-5-メルカプト安息香酸とグルタチオンジスルフィドを生成する (GSSG). 2-ニトロ-5-メルカプト安息香酸は黄色の生成物です, 最大吸収量は 412 nm.

技術仕様

最小検出限界：3.763 μg/mL

線形範囲：12.5-400 μg/mL

必要だが提供されていない試薬と装置

分析天びん, モルタル/ホモジナイザー, 低温遠心分離機, 水浴, 調整可能なピペット, 分光光度計/マイクロプレートリーダー, マイクロガラスキュベットまたは 96 ウェル平底プレートと蒸留水.

手順

私. サンプルの準備

1. 組織サンプル

新鮮な組織を PBS で 2 回洗浄します, それから追加します 0.1 gの動物/植物組織をホモジナイザーに入れる (ホモジナイザーは試薬 I でリンスされ、使用前に氷上に置かれています。). 追加 1 試薬I mL (組織と試薬の割合を一定に保つことができます), 氷上で完全に粉砕する (液体窒素を使用すると、より良い粉砕効果が得られます). で遠心分離します。 8000 ×gの場合 10 4℃で5分, 上清を採取し、4℃に置いて試験します。. (テストが一時的に完了できない場合, 上清は-80℃で保存できます。 10 日々。)

2. 血液サンプル

プラズマ: サンプルは次の温度で遠心分離されます。 600 ×gの場合 10 4℃で5分. 上部の血漿を別のチューブに吸収させ、同量の試薬 I を加えます. で遠心分離します。 8000 ×gの場合 10 4℃で5分, 上清を採取し、4℃に置いてテストします. (テストが一時的に完了できない場合, 上清は-80℃で保存できます。 10 日々。)

血球: サンプルは次の温度で遠心分離されます。 600 ×gの場合 10 4℃で5分. 上部プラズマの廃棄, 3倍量のPBSで洗浄します。 3 回 (PBSで血球を再懸濁します, で遠心分離する 600 ×gの場合 10 分), 同量の試薬 I を加えます. 混合後, それは4℃に置かれます 10 分. で遠心分離します。 8000 ×gの場合 10 分, 上清を採取し、4℃に置いて試験します。. (テストが一時的に完了できない場合, 上清は-80℃で保存できます。 10 日々。)

3. 細胞 サンプル

回収セルは 106 以上である必要があり、PBS で 2 回洗浄します。 (PBSで細胞を再懸濁します, で遠心分離する 600 ×gの場合 10 分). 細胞を再懸濁するための試薬 I の量は、細胞沈殿量の 3 倍です。. 凍結と解凍を2～3回繰り返す (液体窒素で冷凍することをお勧めします, 37℃のウォーターバスに溶解). で遠心分離します。 8000 ×gの場合 10 分, 上清を採取し、4℃に置いて試験します。. (テストが一時的に完了できない場合, 上清は-80℃で保存できます。 10 日々。)

Ⅱ. 手順

1. 予熱分光光度計/マイクロプレートリーダー 30 分, 波長を調整して 412 nm, 蒸留してゼロを設定する
2. 試薬 II を 37℃ で予熱します (哺乳類細胞) または25℃ (他の種) 水浴用 30
3. ブランクチューブの判定: マイクロガラスキュベットを採取する, 追加 20 蒸留水 μL, 140 試薬 II μL, 40 試薬IIIを順番にμL, よく混ぜます, の場所 2 分, そして測定します 412 nm吸光度AB.
4. 検量線の作成

重さを量る 1 mgの標準物質を加えて溶解します。 1 の濃度を求めるための蒸留水 mL 1 mg/mL. 適切な溶液を採取して、次の濃度の標準液を調製します。 200 μg/mL, 100 μg/mL, 50 μg/mL, 25 μg/mLおよび 12.5 μg/mL (標準溶液を希釈する前に試薬 I を 10 倍に希釈してください).

取ってください 1.5 mL EP チューブを加えて 20 標準液 μL, 140 μLの試薬IIと 40 試薬IIIを順番にμL. 各チューブが均一に混合された後, のために立つことが許されています 2 分. 吸光度を測定します。 412 nm, 横軸は吸光度からABを引いた値. 吸光度に応じて検量線を作成します (バツ) そして集中力 (y, μg/mL).

5. サンプルチューブテスト: マイクロガラスキュベットを採取する, 追加 20 サンプルのμL, 140 試薬 II μL, 40 試薬IIIを順番にμL, よく混ぜます, そして立ってください 2 吸光度ATatをテストするのに数分 412 nm, ΔA = AT – AB.
6. マイクロプレートリーダーの操作は分光光度計の操作と同じです。, そして操作は次のように高速です

Ⅲ. 計算

標準曲線によると, サンプルΔAを式に取り込みます(バツ), サンプル濃度 y を計算します (μg/mL).

• タンパク質濃度

GSH (μg/mgプロット)=y×VRV÷VRV÷Cpr =y÷Cpr

• サンプル重量

GSH (μg/g)=y×VRV÷(VRV÷VSV×W)= y÷W

• 細胞量

GSH (μg/104細胞)=y×VRV÷(VRV÷VSV×N)= y÷N

• 溶液量 GSH (μg/mL)=2年

N: 細胞量, 106;

VSV: 上清の総量, 1 mL；

ロープ: 反応系に加えられる上清の量, 20 μL=0.02mL； W: サンプル重量, g;

心肺蘇生法: 上清タンパク質濃度, mg/mL.

2: 血漿の体積 (血球) 1倍に薄められる.

注記:

1. サンプルは完全に均質化する必要があります. テストが一時的に完了できない場合, -80℃で保存可能です.
2. 標準: 還元型グルタチオンは、溶液が完成するときに調製されます。
3. サンプル中のGSH含有量が不明な場合, 事前にサンプルをいくつかの勾配で希釈します。
4. 試薬Iにはタンパク質沈殿剤が含まれているため、, 上清はタンパク質濃度の測定には使用できません. タンパク質含有量を測定する必要がある場合, 別の組織を取ります.

参照:

• アルパート・A・J, ギルバート・H・F. リサイクルポストカラム反応による酸化型および還元型グルタチオンの検出[J]. 分析生化学, 1985, 144(2):553-562.
• オーエンズ C W I, ベルチャー R V. グルタチオンを定量するための比色マイクロ法[J]. 生化学ジャーナル, 1965, 94(3):

関連製品：

BC1180/BC1185 酸化型グルタチオン（GSSG）測定キット

BC1190/BC1195 グルタチオンペルオキシダーゼアッセイキット

BC1150/BC1155 酸化型チオレドキシン還元酵素 (TrxR) アッセイキット

BC1210/BC1215 γ-グルタミン酸-システインリガーゼ (GCL) アッセイ Ki