| 属性 | 詳細 |
|---|---|
| 注記 | テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します |
| 検出器 | 分光光度計 |
| カタログ番号 | BC3400 |
| サイズ | 50T/48S |
コンポーネント:
抽出液: 55mL× 1, で保存されています 4 ℃.
試薬 1: 40mL× 1, で保存されています 4 °Cおよび光から保護されています.
試薬 2: パウダー× 1, で保存されています -20 °Cおよび光から保護されています. 使用する直前, 追加 6 完全に溶解する蒸留水 mL. 未使用の試薬はで保管されます -20 ℃ 1 繰り返しの凍結融解サイクルを避けるために分配してから1週間.
試薬 3: パウダー× 1, で保存されています -20 °Cおよび光から保護されています. 使用する直前, 追加 6 完全に溶解する蒸留水 mL. 未使用の試薬はで保管されます -20 分配後の°C. 繰り返し凍結融解サイクルの禁止.
試薬 4: 91µL× 2, で保存されています 4 °Cおよび光から保護されています. 使用する直前, 追加 0.209 完全に溶解する蒸留水 mL. 保存場所 4 ℃ 1 週.
試薬 5: パウダー× 2, で保存されています -20 °Cおよび光から保護されています. 使用する直前, 追加 0.3 完全に溶解する蒸留水 mL. 未使用の試薬はで保管されます -20 ℃ 1 分配後の週.
試薬 6: 60 µL× 1, で保存されています 4 °Cおよび光から保護されています. 使用する直前, 追加 0.6 完全に溶解する蒸留水 mL. 保存場所 4 ℃ 1 週.
製品説明:
ピロリン酸: フルクトース-6-リン酸-1-ホスホトランスフェラーゼ (PFP, EC2.7.1.90) は、植物組織に広く存在し、フルクトース-6-リン酸のホスホフルクトキナーゼのリン酸化を触媒するサイトゾル酵素です。. 結果として, 単一のPEP触媒反応は可逆反応です, また、ピロリン酸はATPの代わりに使用されます, 光合成の炭素代謝に重要な役割を果たしています.
PFPは、フルクトース6-リン酸のフルクトース1,6-二リン酸への変換を触媒します, アルドラーゼとリン酸トリオースイソメラーゼの作用により、リン酸ジヒドロキシアセトンに変換されます, そして、グリセロール3-二リン酸およびNADからα-リン酸グリセロールデヒドロゲナーゼとNADHによって触媒されます. での吸光度の変化 340 NMは、PFP活性のレベルを反映しています.
必要な材料
低温遠心分離機, 分光光度計, 水浴/一定温度インキュベーター, モルタル/ホモジナイザー, 1 mL石英キュベット, 移送ピペット, 氷と蒸留水, EP管.
手順:
私. サンプル 抽出:
-
- 組織サンプル:
組織の質量によると (g): 抽出溶液の体積 (mL) は 1: 5 ～ 10. 1mLの抽出溶液を含む0.1gの組織を提案しました. 氷の上で完全に粉砕します, 20000gおよび4℃で遠心分離します 15 分. 上清がテストのために氷の上に置かれます.
- 細菌とか細胞とか:
セルの数に応じて (104): 抽出溶液の体積 (mL) は 500 ～ 1000: 1. 推薦する 5 1mlの抽出溶液を含む百万. 超音波を使用して、細菌または細胞を分割します (パワー300W, 作業時間3秒, インターバル7秒, 合計時間 3 分). で遠心分離, 20000gおよび4℃ 15 分. 上清がテストのために氷の上に置かれます.
- 液体: 直接検出.
Ⅱ. 決定 手順:
- 分光光度計を予熱します 30 分, 波長を調整して 340 nm, 蒸留してゼロを設定する
- 次のリストを使用して試薬を追加します:
| 試薬名 (μL) | 試験管 (T) | ブランクチューブ (T) |
| 試薬 1 | 670 | 670 |
| 試薬 2 | 100 | 100 |
| 試薬 3 | 100 | 100 |
| 試薬 4 | 10 | 10 |
| 試薬 5 | 10 | 10 |
| 試薬 6 | 10 | 10 |
| サンプル | 100 | – |
| 蒸留水 | – | 100 |
| 徹底的な混合後, 初期値A1を測定します 340 NMおよび吸光度A2 30 数分 37 °C in 1 mL石英キュベット, それらをa1tとして記録します, A1B, およびa2t, A2B. Δa=を計算します (A1T-A2T)- (A1B-A2B).
注記: 試薬 1, 2, 3, 4, 5, そして 6 操作テーブルの割合に従って作業液に配合することもできます, 現在、使用するために準備されています; 空白のチューブはBEである必要があります 1〜2回作られました. |
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Ⅲ. PFPの計算 活動:
1 マイクロクォーツキュベットによって計算されます
- タンパク質濃度によって計算されます:
単位の定義: 酵素活性の1つの単位がそのように定義されています 1 1分あたりの組織タンパク質のmgが消費します 1 Nmol of Nadh.
PFPアクティビティ (U/mgプロット) =Δa÷（ε×d×vrt×109÷(VS×CPR) ÷t = 53.59×Δa÷cpr
- サンプル重量で計算されます
単位の定義: 酵素活性の1つの単位は、1分あたりの1gの組織が消費されると定義されています 1 Nmol of Nadh.
PFPアクティビティ (U/生重量g) =Δa÷（ε×d×vrt×109÷(w×vs÷ve) ÷t = 53.59×Δa÷w
- 細菌または細胞量によって計算されます:
単位の定義: 酵素活性の1つの単位がそのように定義されています 10 1分あたりの1000個の細菌または細胞が消費します 1 Nmol of Nadh.
PFPアクティビティ (U/104セル) =Δa÷（ε×d×vrt×109÷(vs×n÷ve) ÷t = 53.59×Δa÷n（104）
- 血清およびその他の液体によって計算されます:
単位の定義: 酵素活性の1つの単位がそのように定義されています 1 1分あたりの液体が消費されます 1 Nmol of Nadh.
PFPアクティビティ (U/mL) =Δa÷（ε×d
VRT: 反応システムの総量, 0.001 L;
e: NADH モル吸光係数, 6.22 × 103 L/モル/cm; d: キュベット光のパス, 1 cm;
VS: サンプルボリュームを追加しました, 0.1 mL;
ve: 抽出溶液の量が追加されました, 1 mL; T: 反応時間, 30 分;
心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度, mg/mL; W: サンプル質量, 0.1 g;
109:変換係数, 1 mol = 109 nmol n: セルの数
- 96ウェルUVプレートで計算されます:
D =を変更します 1 dへの上記の式のCM-0.6 cm (96ウェルプレートのライトパス) 計算用.
注記:
- サンプルの数は、酵素反応時間の遅延を避けるために大きすぎてはいけません.
実験例:
- 取る 0.1 豆の芽と追加 1 サンプル処理用の抽出溶液のml. 上清を服用するために遠心分離後, 決定手順に従って進めます. Δa=を計算します (A1T-A2T)-(A1B-A2B)= (1.041-0.963)-0= 0.078. 酵素活性は、サンプル質量に従って計算されます.
PFPアクティビティ (U/生重量g) = 53.59×Δa÷w = 41.8 u/g新鮮な重量.
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