Solarbioホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ (ペプック) 活性アッセイキット

属性	詳細
注記	テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します
操作装置	分光光度計
カタログ番号	BC3310
サイズ	50T/48S

コンポーネント:

抽出液: 60 mL×1. 4℃で保存.

試薬I: 45 mL×1, 4℃で保存.

試薬II: 粉末×1, -20℃、遮光保存. に溶かしてください 35 使用前の試薬 I mL. 使い切れなかった試薬は再包装後、-20℃で保存してください。, 凍結と解凍を繰り返すことは禁止されています;

試薬Ⅲ: 45 μL×1, 4℃、遮光保存. 一時的に使用する前に, 蒸留水を加えて体積比に従って希釈します。 1:120, 溶液をいつ使用するかを準備するため.

試薬IV: 155 μL×1, 4℃、遮光保存. 一時的に使用する前に, 蒸留水を加えて体積比に従って希釈します。 7:250, 溶液をいつ使用するかを準備するため.

試薬V: パウダー×1, -20℃、遮光保存. に溶かしてください 2.5 使用前に蒸留水 mL, 使い切れなかった試薬は再包装後、-20℃で保存してください。, 凍結と解凍を繰り返すことは禁止されています;

製品説明:

ペプック (EC 4.1.1.32) 動物に広く見られる, 開花植物, 藻類, いくつかの菌類, と細菌. この酵素は、オキサロ酢酸からホスホエノールピルビン酸への変換を触媒します。, 糖新生を調節する第一速度制限酵素です.

PEPCKはオキサロ酢酸を触媒してホスホエノールピルビン酸とCO2を生成します, ピルビン酸キナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼは、NADH から NAD+ への酸化をさらに触媒します。, NADH低下率を決定します 340 nm, PEPCK アクティビティを反映できる.

必要だが提供されていない試薬と装置

分光光度計, 低温遠心分離機, 水風呂ポット, 1 mL石英キュベット, 調整可能なピペット, モルタル/ホモジナイザー, 氷と蒸留水

手順

私. 粗酵素液の抽出:

1. 1. 組織サンプル:

組織質量の割合 (g): 抽出液の量 (mL): 1:5~10 (約の重さを量ることをお勧めします 0.1 組織グラム, 追加 1 抽出液 mL) 氷浴ホモジネート用, 次に遠心分離します 8000 ×gの場合 10 4℃で5分, 上清を採取し、試験のために氷上に置きます.

2. 細菌または培養細胞:

初め, 細菌や細胞を遠心管に集めます, そして上清を捨てます. セルの数 (104): 抽出物の量 (mL) は 500-1000:1 (1 抽出液 mL を添加することをお勧めします。 5 何百万もの細菌または細胞), 氷浴中で超音波により細胞を破壊する (力: 200または 20%, 超音波:3s, 間隔:10s, 繰り返す 30 回). 次に、 8000 ×gの場合 10 4℃で5分, 上清を採取し、試験のために氷上に置きます.

3. 血清サンプル: 直接判定.

Ⅱ. テスト 手順:

1. 分光光度計を以上の時間予熱します。 30 分, 波長を調整して 340 nm, 蒸留液でゼロに調整します
2. 実用的なソリューション: 混合試薬 II, 試薬Ⅲ, 試薬 IV の割合 7:1:1(V:V:V) 使用前に. ソリューションをいつ使用するかを準備する.
3. 使用液を37℃に予熱します。 (哺乳類) または 25 ℃ (他の種) のために 5 分.
4. 操作テーブル: 以下の試薬を追加します。 1 mL 石英キュベットを順に:

試薬名 (μL)	ブランクチューブ(B)	試験管(T)
サンプル	–	50
蒸留水	50
実用的なソリューション	900	900
試薬V	50	50
試薬 V を加えてすぐに混合します。. 吸収値A1を測定します 340 10秒はnm、70秒はA2. Δat= a1tを計算します- A2t, ΔAB=A1B- A2B, ΔA =ΔAT-ΔAB. 空のチューブの作業は 1 〜 2 回だけで済みます.

Ⅲ. の計算 ペプック:

1. マイクロ石英キュベットによる計算

• 組織タンパク質濃度から計算:

酵素活性の定義: 酵素活性の 1 単位は、食物の消費を触媒する酵素の量として定義されます。 1 1分あたりのNADHのnmol, タンパク質のすべてのミリグラム.

PEPCK活動 (U/mgプロット) = ΔA÷(ε×d)×VRT×109 ÷ (VS×CPR) ÷ T =3215.4×ΔA÷Cpr

• 組織サンプルの品質によって計算されます:

酵素活性の定義: 酵素活性の 1 単位は、食物の消費を触媒する酵素の量として定義されます。 1 1分あたりのNADHのnmol, サンプル1グラムごとに.

PEPCK活動 (U/生重量g) = ΔA÷(ε×d)×VRT×109 ÷ (VS÷VST×W) ÷T= 3215.4×ΔA÷W

• 細胞数による:

酵素活性の定義: 酵素活性の 1 単位は、食物の消費を触媒する酵素の量として定義されます。 1 毎分あたりの NADH nmol 10 千の細胞

PEPCK活動 (U/104セル)=ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS÷VST×500)÷T=6.43×ΔA

• 血清量から計算:

酵素活性の定義: 酵素活性の 1 単位は、食物の消費を触媒する酵素の量として定義されます。 1 血清 1 ミリリットル当たりの NADH の nmol/分

PEPCK活動 (U/mL) = ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷VS÷T=3215.4×ΔA

e: NADHのモル吸光係数, 6.22×103L/mol/cm; d: キュベットの軽い直径, 1 cm;

VRT: 反応系の総容積, 0.001 L;

VS: 反応系内のサンプル量, 0.05 mL; VST: 抽出液の量, 1 mL;

心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度, mg/mL, タンパク質濃度の自己決定; W: サンプル質量の質量, g;

T: 反応時間, 1 分;

500: 細菌または細胞の総数, 5 百万; 109: 単位換算係数, 1 mol = 109 nmol.

注記:

1. A1がより少ない場合 1 またはΔAはより大きい 0.6, 検出を向上させるために、測定前にサンプルを適切な倍数に希釈することをお勧めします。
2. 酵素活性の高いサンプル用, 動物の肝臓など, 腎臓およびその他の組織, 抽出物を次のように希釈することをお勧めします 5 倍以上
3. ブランクチューブは各試薬成分の品質をテストするためのテストウェルです. 通常の条件下, 変化は06を超えない.
4. サンプルの添加と混合のステップは迅速でなければなりません, ストップウォッチのタイミングは正確でなければなりません. 条件が許せば, これを完了するには 2 人で協力することをお勧めします

実験例:

1. 肝臓0.1gを取り出して加えます 1 ホモジネート用抽出液 ml. 上清を採取し、抽出液で2倍に希釈します。. その後、決定手順に従って操作します. 測定して計算する: ΔAT = A1D- A2D=1.175-0.532=0.643, ΔAB=A1B – A2B =1.29-1.244=0.046, Δa=Δat – ΔAB= 0.643-0.046 = 0.597

PEPCK活動 (U/g質量) = 3215.4×ΔA÷W×10 (希釈率) = 3215.4×0.597÷0.1×10=191959.4U/質量g.

2. アロエベラ0.1gを取り、加えます 1 均質化用抽出液 ml, 上清を採取し、測定手順に従って操作します。. ΔAT = A1T の測定と計算- A2T=1.257-1.106=0.151, ΔAB=A1B- A2B =1.29-1.244=0.046, Δa=Δat – Δab = 0.151-0.046 = 0.105

PEPCK活動 (U/g質量) = 3215.4 ×ΔA÷W＝3215.4×0.105÷0.1＝3376.17U/g質量.

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