ソーラーバイオ酸化グルタチオン (GSSG) コンテンツアッセイキット

酸化グルタチオン (GSSG) コンテンツアッセイキット

注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.

操作装置: 分光光度計/マイクロプレートリーダー

カタログ番号: BC1185

サイズ:100T/96S

コンポーネント:

試薬I:100 mL×1. 4℃で保存. 試薬II: 130 μL×1. 4℃で保存. 試薬Ⅲ: 20 mL×1. 4℃で保存. 試薬IV:2.5 mL×1. 4℃で保存.

試薬V: パウダー×1. 4℃で保存. で溶かす 2.5 溶液を使用する場合は蒸留水 mL, 次に、小さなパッケージに分割されます, -20℃で保存.

試薬VI:12.5 μL×1. 4℃で保存. の比率でサンプルサイズに応じて試薬VIと蒸留水を準備する 1:20 (V: V) 使用前に.

標準: 粉 10 mg×1. 4℃で保存.

製品説明

酸化グルタチオン(GSSG) グルタチオンの酸化型です (GSH), Dithioneglutathioneとしても知られています, グルタチオンの2つの分子の酸化によって形成されます. GSSGは、グルタチオンレダクターゼによってGSHに縮小されます, したがって、体のほとんどは縮小された形にあります. GSHおよびGSSGの含有量の決定と細胞内のGSH/GSSGの比率は、細胞の酸化還元状態を反映できます. このキットは、グルタチオンの反応を利用します 5, 5′-dithiobis-2-ニトロベン酸 (DTNB) 5-Thio-2を生成します- ニトロ安息香酸. 5-Thio-2- ニトロベンゾ酸は、波長で最大の吸収を持っています 412 nm, および2-ビニルピリジンは、サンプルの元のグルタチオンの減少を阻害します, そして、グルタチオンレダクターゼを使用してGSSGをGSHに減らします, 酸化されたグルタチオンの含有量の決定.

技術仕様

最小検出限界：3.211 μg/mL

線形範囲：3.9-125 μg/mL

必要だが提供されていない試薬と装置.

分析天びん, モルタル/ホモジナイザー, 冷蔵遠心分離機, 水浴, 調整可能なピペット, 分光光度計/マイクロプレートリーダー, マイクロガラスキュベット/96ウェル平底プレート.

手順

私. サンプル 準備

1. 1. 組織サンプル

新鮮な組織を PBS で 2 回洗浄します, それから追加します 0.1 ホモジナイザーへのサンプルのg (ホモジナイザーは試薬 I でリンスされ、使用前に氷上に置かれています。). 追加 1 試薬I mL (組織と試薬の割合は一定に保つことができます), 氷上で完全に粉砕する (液体窒素を使用すると、より良い粉砕効果が得られます). で遠心分離します。 8000 ×gおよび4 for 10 分, 上清を採取し、4℃に置いて試験します。. (上清は-80℃で保存できます 10 日々。)

2. 血液サンプル

プラズマ: サンプルは次の温度で遠心分離されます。 600 ×gおよび4 for 10 分. 上部プラズマを別のチューブに吸収して、同じ体積試薬を追加しますi. で遠心分離します。 8000 ×gおよび4 for 10 分, 上清を採取し、4℃に置いて試験します。. (上清は-80℃で保存できます 10 日々。)

血球:サンプルは次の温度で遠心分離されます。 600 ×gおよび4 for 10 分. 上部プラズマの廃棄, PBSのトレブル量で洗浄します 3 回 (血球をPBS遠心分離機と混合します 600 ×gの場合 10 分), 同量の試薬 I を加えます. 混合後, それは4℃に置かれます 10 分. で遠心分離します。 8000 ×gの場合 10 分, 上清を採取し、4℃に置いて試験します。. (上清は-80℃で保存できます 10 日々。)

3. 細胞サンプル

収穫細胞は106以上、次にPBSで2回洗う必要があります (600×gのPBS遠心分離機とセルを混合します 10 分), 沈殿した細胞をPBSの量と混合します 3 回. 凍結と解凍を2～3回繰り返す (液体窒素で凍結することをお勧めします, 37℃のウォーターバスに溶解). で遠心分離します。 8000 ×gの場合 10 分, 上清を採取し、4℃に置いて試験します。. (上清は-80℃で保存できます 10 日々。)

Ⅱ. 手順

1. 予熱分光光度計/マイクロプレートリーダー 30 分, 波長を調整して 412 nm, 蒸留してカウンターをゼロに設定します
2. 水浴で予熱した試薬II 30 分: 37℃ (哺乳類細胞) または25℃ (他の種).
3. 標準希釈: で標準を溶解します 1 蒸留水 mL (4℃) の濃度に 10 mg/mL. 125μg/mlの濃度の標準を準備するための適切なソリューションを取得してください、 5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、7.8125μg/mL、3.90625μg/mland0μg/ml (希釈液は10倍希釈試薬iです).

4. 追加 20 μLの希釈標準またはサンプル 0.5 ML遠心チューブ, 追加 1 試薬 II μL, でインキュベートします 37 for 30 混合後数分.
5. 標準曲線を作成します

インキュベーション後, 追加 140 試薬IIIのμL, 20 試薬 IV μL, 20試薬vのμL, そして 2 標準チューブへの試薬VIのμL. 迅速な混合後, の光吸収A1とA2 30 sと 150 Sをそれぞれ測定しました 412 nm. 吸光度 (A2-A1) アブシッサです (バツ) 濃度は縦座標です (y), 標準曲線を作成します.

追加 140 試薬IIIのμL, 20 試薬 IV μL, 20 試薬vのμL, そして 2 μlof試薬VIは、順番にサンプルチューブにvi. 迅速な混合後, の光吸収A1とA2 30 sと 150 Sをそれぞれ測定しました 412 nm, Δa= a2- A1.

Ⅲ. 計算

標準曲線によると, ΔAを式にサンプリングします (バツ), yのサンプル濃度を計算します

(μg/ml).

• タンパク質濃度

GSSH (μg / MG PROT)= y×vrv÷vrv÷cpr = y÷cpr

• サンプル重量

GSSH (μg /g)= y×vrv÷(VRV÷VSV×W)= y÷W

• セラマウント

GSSH (μg /106 細胞)= y×vrv÷(VRV÷VSV×n)= y÷N

• ソリューションボリューム

GSSH (μg / mL)= y×vrv/vs = 2y

N: 細胞量,106；

ロープ: 総反応量, 0.203 mL；

VSv: 上清の量を反応システムに加えました, 20 μL=0.02mL； W: サンプル重量, g;

心肺蘇生法: 上清タンパク質濃度, mg/mL.

ノート:

1. サンプルは完全に均質化する必要があります. テストが一時的に完了できない場合, -80℃で保存可能です.
2. サンプル内のGSSGコンテンツの内容が不確かな場合, 測定前にいくつかの勾配を希釈できます.
3. この方法では、酵素反応速度を使用して、基質濃度と完全な測定値をできるだけ正確に計算します。 30 そして 150
4. 試薬私はタンパク質沈殿剤を含んでいた, 上清をタンパク質濃度測定に使用できませんでした. タンパク質含有量を測定する必要がある場合, 別の組織を取ります.

参照:

• アルパート・A・J, ギルバート・H・F. リサイクルポストカラム反応による酸化型および還元型グルタチオンの検出[J]. 分析生化学, 1985, 144(2):553-562.
• オーエンズ C W I, Belcher rグルタチオンの測定のための比色性マイクロメソッド[J]. 生化学ジャーナル, 1965, 94(3): 705.

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