ソーラーバイオ乳酸脱水素酵素 (LDH) 活性アッセイキット

乳酸脱水素酵素 (LDH) 活性アッセイキット

注記: テスト前に予測のために 2 つまたは 3 つの異なるサンプルを取得します.

操作装置: 分光光度計/マイクロプレートリーダー

カタログ番号: BC0685

サイズ:100T/48S

コンポーネント:

抽出液: 60 mL×1. 4℃で保存；

試薬I: 7 mL×1. 4℃で保存.

試薬II: 粉末×1. -20℃で保管. 実用的なソリューション: と溶ける 1.3 使用前に蒸留水 mL. マッチング後に細管に分割可能, -20℃で2週間保存可能. 凍結と解凍の繰り返しを避ける.

試薬Ⅲ: 7 mL×1. 4℃で保存.

試薬IV: 25 mL×1. 4℃で保存.

ピルビン酸ナトリウム標準液: 1 mL (2 μmol/mL) ×1. 4℃で保存.

製品説明:

乳酸脱水素酵素 (LDHとかLDとか) ほぼすべての生細胞に存在する解糖経路の末端酵素です。 (動物, 植物, そして原核生物). LDHは乳酸からピルビン酸への変換とその逆の変換を触媒します。, NAD+をNADHに変換し、またその逆に変換するため.

NAD+と乳酸はLDHの触媒作用によりピルビン酸に酸化されます。. ピルビン酸はさらに 2,4-ジニトロフェニルヒドラジドと反応してピルビン酸ジニトロベンゾンを形成します, アルカリ溶液中では赤褐色を示し、色の深さはピルビン酸の濃度に比例します。.

必要だが提供されていない試薬と装置:

分光光度計/マイクロプレートリーダー, サーモスタット水浴, 卓上遠心分離機, 調整可能なピペット, マイクロガラスキュベット/96ウェル平底プレート, モルタル/ホモジナイザー, 氷, 蒸留水.

手順:

私. サンプル 準備:

1. 細菌, 細胞, または組織サンプル:

細菌とか細胞とか:

細菌や細胞を遠心管に集める. 遠心分離後、上層の液体を廃棄します. 細菌/細胞量の比率 (104): 抽出液量 (mL) 500~1000です:1(およそ摂取することをお勧めします 5 百万個の細菌/細胞を追加 1 抽出液 mL). 超音波で細菌と細胞を分解する (氷の上に置かれた, 200W, 作業時間3秒, 間隔10秒, 繰り返します 30 回). で遠心分離します。 8000 rpm 4℃用 10 分, 上清を採取し、試験のために氷上に置きます.

組織:

氷浴の均一性は組織質量の比率に従って行われます。 (g): 抽出液量 (mL) = 1: 5~10 (およそ摂取することをお勧めします 0.1 ティッシュ1gを加えて 1 抽出液 mL). 氷浴による均質化. で遠心分離します。 8000 rpm、4℃ 10 分, 上清を採取し、試験のために氷上に置きます.

2. 血清 (プラズマ)サンプル:

サンプルを直接検出.

Ⅱ. 手順:

1. 分光光度計/マイクロプレートリーダーを予熱します 30 分, 波長を調整して 450 nm, 蒸留水でゼロを設定する.
2. ピルビン酸ナトリウム標準液: 取る 100 標準液 μL, に希釈する 1, 5, 0.25, 0.125, 0 μmol/mL, そして使用します 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0 標準曲線としてμmol/mL.

3. サンプルテスト

試薬名 (μL)	試験管(で)	コントロールチューブ(Ac)	標準チューブ(として)
サンプル	10	10	–
標準ソリューション	–	–	10
試薬I	50	50	50
試薬II	10	–	–
蒸留水	–	10	10
しっかりと混ぜ合わせます, 37℃で保温(哺乳類) または25℃(他の種) 水浴用 15 分.
試薬Ⅲ	50	50	50
しっかりと混ぜ合わせます, 37℃で保温(哺乳類) または25℃(他の種) 水浴用 15 分.
試薬IV	150	150	150

しっかりと混ぜ合わせます, 室温に置いてください 3 分. 取る 200 マイクロガラスキュベット/96ウェル平底プレート内の反応液μL, で吸光度を測定した 450 nm, ΔA=AT-AC. 各試験管にはコントロールチューブをセットする必要があります.

Ⅲ. LDH 計算.

1. ピルビン酸ナトリウム含有量のサンプル
2. 標準曲線を設定する, y 軸は標準濃度, μmol/mL, x 軸として 450 nm吸収. ΔAを入れる(バツ) 標準曲線に, yを計算する(μmol/mL)
3. 血清 (プラズマ) LDH アクティビティのサンプル

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 1分あたりのピルビン酸nmol, 血清1ミリリットルごとに.

LDH(U/mL)=y÷T×103=66.7×y

4. 組織, 細菌または培養細胞のLDH活性

あ. タンパク質濃度:

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 1分あたりのピルビン酸nmol, タンパク質のすべてのミリグラム.

LDH(U/mgプロット)= y÷T÷Cpr×103 =66.7×y÷Cpr

B. サンプル重量

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 1分あたりのピルビン酸nmol, 組織のあらゆるグラムに. LDH(U/g)= y÷T÷W×103 =666.7×y

C. 細胞量

単位の定義: 酵素活性の 1 単位は、次の生成を触媒する酵素の量として定義されます。 1 毎分あたりのピルビン酸 nmol 10000 細胞.

LDH(U/104セル)= y÷T÷500×103 =0.133×y

対: 上澄みのボリューム (mL), 0.01 mL; VSv: 抽出液量, 1 mL; T: 反応時間, 15 分;

心肺蘇生法: サンプルタンパク質濃度, mg/mL; W: サンプル重量, 0.1 g;

500: 細菌または細胞の総数, 5 百万; 103: 1 μmol/mL=103nmol/mL.

参考文献

[1] ファン・PH, f, 黄 C S, 他. オリゴガラクツロニドの取り込みと成長阻害に対するその効果, ヒト癌細胞の乳酸デヒドロゲナーゼ活性とガラクチン-3放出[J]. 食品化学, 2012, 132(4): 1987-1995.

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