ワンステップ RT-qPCR キット (プローブ)
商品番号：ER101 仕様：50T/100Tストレージ: -20℃で保存
製品導入：
この製品は、ワンステップ逆転写の蛍光蛍光定量のための特殊な試薬です PCR (rt-qpcr) プローブメソッドを使用します. この製品との1つのステップRT-QPCR反応を実行すると、同じ反応チューブ内で継続的な処理が可能になります, 検出感度を高めながら、手順を簡素化し、サンプル間の相互汚染を回避する. このアッセイキットは、新しい逆転写酵素を採用しています (Hi-MMLV逆転写酵素), 新しく設計された抗体修飾ホットスタートTAQ DNAポリメラーゼ, ワンステップRT-QPCR酵素ミックスの形でのRNase阻害剤. 強化されたRNA親和性を特徴としています, 熱安定性, より高い増幅効率, そして特異性. これにより、広い定量範囲内の堅牢な標準曲線の生成が可能になります, 異なる発現レベルでのさまざまな標的遺伝子の正確な定量化を促進する. 優れた再現性と高い信頼性を提供します.
商品内容：
| コンポーネント | ER101-01 | ER101-02 |
| 1ステップRT-QPCR酵素ミックス | 50μL | 100μL |
| 5×ワンステップRT-QPCRマスターミックス | 250μL | 500μL |
| RNaseフリーDDH2○ | 1mL | 2×1ml |
ストレージ:
-20℃で保存, 最低保存期間は 12 月.
アクティビティの定義:
活性化されたマヒマヒ精子 DNA をテンプレート/プライマーとして使用する, アクティビティは次のように定義されます 1 ユニット (U) 酸不溶性物質が組み込まれている, 取り上げることで 10 ヌクレオチドの nmol 30 74℃で5分.
製品の用途:
このアッセイキットは、プローブベースのワンステップリバース転写リアルタイム蛍光定量PCRに適しています. RNA発現の正確で簡単な分析を可能にします, 特に少量のRNAを検出するのに適しています. さまざまな種類の蛍光定量的PCR機器と互換性があります.
注記：特定の企業向け’ 井戸間蛍光シグナルの不一致を示すリアルタイムPCR増幅機器, これらのエラーを修正するためにROXリファレンス染料を取得するためにメーカーに連絡するか、メーカーに連絡してください. 詳細な詳細は、実験設計に基づいて選択する必要があります, 機器マニュアル, または、さまざまな蛍光プローブの特定の使用要件.
さらに, このアッセイキットにはGDNAは含まれていません (ゲノムDNA) 取り外しコンポーネント. 実験にGDNA干渉からの自由が必要な場合, GDNA除去ステップ中または後に実施してください RNA抽出 そして、このアッセイキットを使用して実験を進めます. この予防措置は、実験結果との潜在的な干渉を防ぎます.
操作手順:
- RNaseフリーの遠心管で次の反応混合物を準備します:
| 試薬 | 使用額 | 最終濃度 |
| 1ステップRT-QPCR酵素ミックス | 1μL | — |
| 5×ワンステップRT-QPCRマスターミックス | 5μL | 1× |
| フォワードプライマー (10μM) | 0.5-2.5μL | 0.2-1.0μM |
| 最初にリバースします (10μM) | 0.5-2.5μL | 0.2-1.0μM |
| プローブ (10μM) | 0.25-1μL | — |
| 総RNA | 1PG-1µg | — |
| RNaseフリーDDH2○ | 最大25µl | — |
注記：各成分の量は実際のニーズに応じて調整できます.
- 次の条件下で1つのステップRT-QPCR反応を実行する:
| 方法・手順 | Sタルダード procedure | Quick procedure | サイクル |
| 50℃ | 15分 | 10分 | 1 |
| 95℃ | 3分 | 1分 | 1 |
| 95℃ | 15s | 5s | 45サイクル |
| 60℃ | 30s | 20s |
- 反応が完了した後, リアルタイムPCR機器の増幅曲線を確認し、結果を分析します.
予防:
- ワンステップRT-QPCR酵素ミックスには、高濃度のグリセロールが含まれています. ご使用の前に, ミックスを簡単に遠心にして、反応チューブの底に収集してください. 上下に穏やかにピペットを徹底的に混ぜます. 反応セットアップ用, RNaseフリーのピペットのヒントを使用します, EPチューブ, 等, そして、可能な限り汚染を避けてください.
- 通常, のプライマー最終濃度 0.2 µMは最適な増幅に十分です. 反応性能が最適ではない場合, の範囲内でプライマー濃度を調整します 0.1 に 1.0 μM. プローブ濃度は間に調整できます 50 NMと 250 nm. QPCRは非常に敏感です, 反応セットアップ中のテンプレート量の精度は、最終的な定量化結果に大きく影響します. テンプレートを希釈することをお勧めします (例えば, 希薄 2-5 サンプルのµL) 実験的な再現性を高めるために反応ミックスに追加する前に.
- 範囲内の増幅製品の長さを選択します 80 bp to 200 血圧. 複雑な二次構造と高GC領域を持つテンプレート用, 逆転写温度を55°Cに上げると、増幅効率と検出感度が向上する可能性があります.
- 実際のリアルタイムPCR機器が使用されているかどうかを確認してください迅速な増幅サイクルをサポートする. 最初の試行の場合, 確認するために予備実験を実施します. 使用される特定のリアルタイムPCR機器で必要な最短のデータ収集時間制限に従って延長時間を調整する. ABIのような楽器用 7700 とアビ 7900, 少なくとも使用してください 30 秒. ABIの場合 7000 とアビ 7300, 少なくとも使用してください 31 秒. ABIの場合 7500, 少なくとも使用してください 34 秒. リアルタイムPCR機器のABIシリーズを使用する場合, 溶液の準備にROXリファレンス染料を含めます.
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