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製品導入：
この試薬キットは、羽などのサンプルでCHD-W保存遺伝子を増幅および検出できます, 血, and tissues of pigeons, それにより、性別を決定します. 内因性内部参照を導入することにより, 核酸抽出および増幅プロセスを監視して、テスト結果の精度を確保することができます.
商品内容：
| 試薬成分 | AN2306001-01（24T） | AN2306001-02（48T） |
| GW reaction solution | 23μL/ウェル×8ウェル/ストリップ×3ストリップ | 23μL/ウェル×8ウェル/ストリップ×6スチップ |
| GW Positive control | 100μL | 100μL |
| ネガティブコントロール | 100μL | 100μL |
保管条件：
-20℃で保存, 保存期間は少なくとも 12 月
実験運用：
1. サンプルの準備 (サンプル準備エリア)
1.1 サンプル要件：
羽毛: 少なくとも収集します 5 胸から羽が出る, 腹部, または足 (羽根軸部分を含む), 自然に抜け落ちた羽毛は使用しません。.
血: 抗凝固剤としてEDTAを使用する, ヘパリンを抗凝固剤として使用しないでください. 新鮮な全血を使用する必要があります, または2~8℃で最長保存可能 7 日々, または-20℃で最長保存 3 月. 凍結と融解を繰り返すことはできるだけ避けてください。.
組織: 新鮮な筋肉または臓器組織を採取する (皮膚のあるサンプルの使用を避ける, 腱, 加工が難しい筋膜や) 100mg以下. 200～500μLの滅菌水を使用して組織ホモジネートを調製します, その後、次のサンプル前処理に進みます。.
1.2 サンプルの準備：
Three Lions Biotech のマニュアルを参照してください。 “動物ゲノム DNA 迅速抽出キット (のために PCR 分析)” (部品番号: DP202), または関連要件を満たすその他の核酸抽出キット/方法, 加工サンプルの抽出用. 抽出したサンプル核酸をアイスボックスに入れ、速やかに検査を続行してください。. 4℃で最長3年間保存可能 7 数日または -20°C で最長 6 月.
2 . 反応系の準備 (サンプルを追加するための反応エリア).
2.1 Take out n+2 reaction tubes containing GW positive control, GW negative control, 実験に必要な反応液と (n はテストするサンプルの数を表します, プラス 1 ポジティブコントロール, そして 1 ネガティブコントロール). 試薬を室温で完全に解凍します。, 遠心分離機用 10 秒, チューブの壁とキャップ内の液体をチューブの底まで回転させます. 後で使用するためにアイスボックスに入れてください.
2.2 それから, 2μLのネガティブコントロールを加えます, 抽出されたサンプル核酸, and GW positive control to the reaction solution in sequence. チューブのキャップを閉めます, 適切な記録を作成する, 各反応の総量が 25μL であることを確認します。. 中身をよく混ぜ合わせます, 遠心分離機用 10 秒, その後、PCR 装置で増幅実験を続行します。.
3. PCR増幅 (増幅および生成物分析エリア).
PCR増幅プロセスは次のとおりです。: 95℃で予備変性 3 分; 95℃で変性 10 秒, Annealing and extension at 58℃ for 30 秒, 合計で 35 サイクル. Collect fluorescence signals at 58℃. 蛍光検出では, 最初のチャンネルに FAM を選択します (for the CHD-W gene), 2 番目のチャンネルに VIC/HEX を選択します (for the endogenous reference gene). ABIシリーズリアルタイム蛍光定量PCR装置を使用する場合, 事前にメーカーに問い合わせるか、必要に応じて自分で ROX キャリブレーション色素を追加することもできます; さもないと, 通常の手順に従ってください.
4. 結果の判定
4.1 FAM チャネルと VIC/HEX チャネルの両方のポジティブ コントロールの Ct 値が <28 そして、 “S”-整形された増幅曲線, ネガティブコントロールには Ct 値がないか、Ct 値が 35 以上であり、 “S”-整形された増幅曲線, 実験結果は有効です. さもないと, 実験は繰り返されるべきだ, 繰り返し実験がまだ無効である場合, メーカーの技術担当者にお問い合わせください.
4.2 VIC/HEXチャネルのサンプルのCT値は≤30である必要があり、 “S”-整形された増幅曲線, サンプルの抽出と増幅が効果的であることを示しています. Ct値が無い場合、またはCt値が 30 < CT ≤ 35 VIC/HEX チャンネル内, サンプルの核酸抽出が標準に達していない、または強い阻害干渉があることを示します。 (アルコールや消毒剤の残留物など, 抗凝固剤, 等) 増幅を阻害するもの. 核酸の抽出と増幅のためにサンプルを再処理することをお勧めします。.
4.3 VIC/HEX チャンネルの検出が有効になった後, FAM チャネルでの決定は次のように実行されます。:
- Ct値≦ 30 そして “S”-整形された増幅曲線が観察される, CHD-W遺伝子の陽性として決定されます, サンプルが女性からのものであることを示します.
- Ct値は 30 < CT < 32, すべてが疑わしいと見なされます, 再テストをお勧めします (最初に除外することをお勧めします “偽陽性” 環境エアロゾル汚染によって引き起こされる結果, そして、核酸抽出と試験を進めます). エアロゾル汚染を除外した後の FAM チャンネルでの再検査で Ct 値が示された場合 < 30 明確な増幅曲線, CHD-W遺伝子の陽性として決定されます; さもないと, 陰性と判定される.
- Ct値なし、またはCt値≧ 32 そしていいえ “S”-整形された増幅曲線, CHD-W遺伝子に対して陰性として決定されます, サンプルが男性から来る可能性があることを示します.
予防：
1contamination汚染を防ぐため, 実験は厳密に分割された操作で実行する必要があります. 人的要因による相互汚染を避けるために、パーティション間を物理的に隔離することが望ましい. 実験中は白衣とラテックス手袋を着用してください, 異なる領域で別々のツールを使用する. 必要に応じて手袋と白衣を交換します. PCR後, すぐに蓋を開けないでください. エアロゾル汚染を最小限に抑えるため、サンプリングのために開ける前に十分に冷却するまで待ってください。.
2shoteする前に試薬を完全に解凍します, ただし、凍結と融解を繰り返すことは避けてください。. 試薬の調製については指示に厳密に従ってください, サンプル追加, およびその他の手順. 作業台, 遠心, ピペット, その他の器具は塩素含有消毒剤を使用して定期的に消毒する必要があります。, エタノール, 核酸汚染除去剤, または紫外線ランプ.
3否定的な結果は、必ずしも男性を意味するわけではありません. 未知の突然変異, サンプルの品質が悪い, 低濃度, または核酸抽出における強力な阻害物質の存在 (テスト) につながる可能性もあります “ネガティブ” 結果. このキットは、オウムの CHD-W 遺伝子の特異的増幅のみに使用されます。. その他の製品について, メーカーにご相談ください.
4）この製品は単一使用のみです. 凍結と融解を繰り返さないでください. 科学研究のみを目的としており、臨床診断やその他の目的には使用しないでください。.
