実験計画
この実験では、植物材料を粉砕および精製して粗DNA抽出物を取得します。. この抽出物は、沈殿物中に存在する DNA を識別するために使用されます。.
粗抽出
粗製 DNA の溶解度は最初は低下し、その後 NaCl の濃度が増加するにつれて増加します。, ～の濃度で最小値に達する 0.14 モル/L.
粗DNA抽出液にエタノール溶液を加えるとDNAが沈殿します。. NaCl 濃度では、 0.14 粉砕液中のmol/L, DNAの溶解度は最小限です, これは、粉砕中の DNA の溶解には好ましくありませんが、DNA の沈殿を促進します。. 一方で, NaCl濃度で 2 粉砕液中のmol/L, DNAの溶解度が高い, DNAの溶解を助ける, ただし、沈殿効果は低 NaCl 濃度の粉砕溶液ほど良くありません。. したがって, 粉砕溶液中のさまざまな NaCl 濃度が粗製 DNA 抽出に及ぼす影響については、さらなる分析が必要です.
精製
不純物の除去方法には遠心分離などがあります, 75℃の水浴, そして寒い (4℃) 落ち着く. 粗 DNA 抽出物を遠心分離すると、細胞断片が分離され、遠心分離管の底にタンパク質が沈殿します。, DNA の大部分は上清に残りますが、. DNAとタンパク質の耐熱性の違いを利用して, DNA抽出物を75℃に維持する 10 ウォーターバスに数分間浸すと、タンパク質の変性と沈殿が起こります。. 4℃での冷沈降によりタンパク質がさらに沈殿します, 多糖類, および他の物質, 不純物の除去を実現.
識別
酸性溶液中で DNA を加熱すると、分子内の 2-デオキシリボース残基が分解されます。, その結果、2-デオキシリボースとω-ヒドロキシ-γ-ケトバレルアルデヒドが生成されます。. 後者はジフェニルアミンと反応して青色の化合物を生成します。. この反応は、事前に DNA を NaCl 溶液に溶解する必要がなくても起こります。.
この実験には DNA の粗抽出が含まれます, と砂糖, タンパク質, DNA サンプル中の誘導体もジフェニルアミンによりさまざまな色の物質を形成する可能性があります。. したがって, ジフェニルアミン法は正確な識別法ではありません. 核酸とタンパク質は、紫外領域の波長で吸収のピークを持ちます。 260 nmと 280 nm, それぞれ. DNA 濃度は、次の吸光度を通じて間接的に計算できます。 260 nm: DNA濃度 (μg/mL) =A260× 100 × 50. さらに, A260 と A280 の比率を計算することで DNA 純度を評価できます. 純粋な DNA の A260/A280 比は次のとおりです。 1.8, この比率はタンパク質汚染があると大幅に減少します。.
底質の質を比較してみると, DNA濃度, そして純粋さ, 2 セットの試験管間のジフェニルアミン識別における色の変化と同様に, DNA抽出のためのさまざまな実験的処理の有効性を分析できます.
材料と方法
実験の準備
装置: シャーレ, ビーカー, メスシリンダー, ガラス棒, 寒冷紗, 乳鉢と乳棒, 試験管, 試験管立て, 漏斗, 電子天秤, 分析天秤, 遠心分離管, 遠心分離機, 水浴, 超顕微鏡核酸・タンパク質分析装置 NanoDrop Lite, 新鮮なカリフラワー.
試薬: 95% -20℃で凍結したエタノール, ジフェニルアミン試薬.
研削液: 溶解する 1.01 トリスのg (ヒドロキシメチル) アミノメタン 5 蒸留水 mL, pHを調整する 8.0 使用して 2 mol/L塩酸, それから追加します 0.876 (または 11.69) NaCl グラム, 3.72 エチレンジアミン四酢酸 g (EDTA), そして 2 g ドデシル硫酸ナトリウム (SDS). 上記の化学物質がすべて溶解した後、, ボリュームを補う 100 蒸留水で mL.
メソッドのステップ
① 粉砕と濾過: NaCl濃度の粉砕溶液でカリフラワーを粉砕する 0.14 モル/Lと 2 モル/L, 次に濾過して上清を収集します.
② 不純物の除去: 不純物を除去するための 3 つの異なる方法で上清を処理します。, つまり遠心分離, 75℃の水浴 + 4℃のセトリング, またはわずか 4°C で安定. 遠心分離パラメータは次のとおりです。 3,000 回転数, 2 分, 室温で. “75℃の水浴 + 4℃のセトリング” 上清の入った試験管を 75°C のウォーターバスに入れ、 10 分, 続いて4℃の冷蔵庫内で静置を続けます。 10 分. “わずか 4°C での沈降” 上清を 4°C の冷蔵庫に保管することを意味します。 10 分.
③ 降水量: 同量の冷エタノールを試験管に注ぎます, そしてそれを落ち着かせてください. 白い綿状物質が出てきたら, ピンセットを使用して沈殿物を取り除きます, 自然乾燥, そして重さを量る.
④ 識別: NanoDrop Lite 超顕微鏡核酸/タンパク質分析装置を使用して、DNA 濃度を測定し、サンプルの DNA 純度を分析します。. 定性的同定はジフェニルアミン試薬を使用して行われます. サンプルは、ジフェニルアミンの同定前に溶解されないか、または次の濃度の NaCl 溶液に溶解されません。 2 異なる体積のmol/L.
推奨事項
研削液NaCl濃度の最適化
実験結果は次のことを示しています, DNAの濃度や純度の点で, DNA 抽出効率は、粉砕溶液の NaCl 濃度がより優れています。 2 mol/Lとの比較 0.14 モル/L. これは、NaCl 濃度が 2 モル/L, DNAの溶解度が高い. NaCl濃度は 0.14 mol/L は、後の DNA 沈殿にとってより有利です。 (に比べ 2 モル/L), エタノールの作用により効果は弱い. さらに, NaCl濃度が高くなると、塩分効果が誘発される可能性があります, タンパク質の沈殿を促進する, それはにとって有益です DNA精製. したがって, 粉砕溶液の NaCl 濃度を選択することをお勧めします。 2 モル/L.
不純物除去方法の最適化
実験結果は、異なる不純物除去方法にはそれぞれ長所と短所があることを示しています, タンパク質を除去する際にある程度の DNA 損失が発生します. DNAの純度から解析する, 遠心分離が最適です; DNA濃度から, 4°C のセトリングが最適です; コストと運用難易度を考慮して, 4°C のセトリングが最適です. したがって, 3 つの不純物除去方法が実験結果に及ぼす影響は同様です, ただし、4°C での安定化はコスト効率が高くなります, 操作が便利, 時間とコストが限られている場合に実用的.
沈殿物処理の最適化
実験結果は、次の場合に識別結果がより優れていることを示しています。 “沈殿物を溶解しない。” これは、ジフェニルアミンが水と接触すると乳白色の溶液を形成するためと考えられます。, 灰青色の観察を妨げる. また, 溶液を希釈すると色が薄くなる場合があります, 明確な現象を観察することが困難になる. さらに, ジフェニルアミンは互いに吸着する可能性があります, 白い小さな粒子を形成する, 色の反応を妨げる. しかし, 同定のために沈殿物をジフェニルアミン試薬に直接添加するか、沈殿物を少量の溶液に溶解することをお勧めします。 2 識別用のmol/L NaCl溶液 (推奨量はジフェニルアミン量の 4 分の 1 です。). このアプローチにより、沈殿物の溶解による識別感度の低下が回避されます。.
