La proteinasi K è importante enzima utilizzato nei laboratori di biologia molecolare per digerire e rimuovere proteine dalle preparazioni di acidi nucleici. Questo enzima proteolitico ha proprietà chiave che lo rendono eccezionalmente utile per applicazioni di ricerca. In questo articolo, esploreremo cos’è esattamente la proteinasi K, come funziona, e i suoi molteplici usi in laboratorio.
Cos'è la proteinasi k?
La proteinasi K è una serina proteasi ad ampio spettro isolata dal fungo Tritirachium album. Può digerire rapidamente le proteine in frammenti peptidici e amminoacidi più piccoli.
Il nome “proteinasi K” deriva dalla sua capacità di digerire la cheratina, una proteina strutturale resistente presente nei capelli, unghia, piume, eccetera. Il fungo Tritirachium album secerne la proteinasi K quando la cheratina viene fornita come unica fonte di azoto.
Quali sono i fatti sulla proteinasi K?
Alcuni fatti chiave sulla proteinasi K:
- Classificazione: Appartiene alla famiglia delle peptidasi S8 (famiglia della subtilisina)
- Tipo catalitico: Proteasi serina
- pH ottimale:5 – 12.0
- Temperatura ottimale:50°C – 65°C
- Peso molecolare:28,930 E
La proteinasi K contiene una triade catalitica di tre aminoacidi – aspartato, istidina, e serina. La serina agisce come un nucleofilo che scinde i legami peptidici. Gli ioni calcio sono importanti per la piena attività enzimatica.
Come funziona la proteinasi K?
Come una proteasi serina, la proteinasi K catalizza l'idrolisi dei legami peptidici adiacenti al gruppo carbossilico degli amminoacidi alifatici e aromatici.
Il suo meccanismo d'azione assomiglia a quello di altre serina proteasi come la chimotripsina e la tripsina. Ecco i passaggi chiave:
- La serina catalitica dell’enzima avvia un attacco nucleofilo al carbonio carbonilico del legame peptidico.
- Questo forma un intermedio tetraedrico stabilizzato mediante legami idrogeno.
- Il legame azoto-carbonio quindi si rompe, rilasciando il primo prodotto e formando un intermedio acil-enzimatico.
- Una molecola d'acqua disattiva l'enzima, rilasciando il secondo prodotto.
- Questo rigenera il sito attivo della serina per un altro ciclo di catalisi.
La proteinasi K scinde le proteine sui legami peptidici interni come un'endopeptidasi. Non ha una specificità rigorosa ma preferisce grandi residui idrofobici. Ciò gli consente di scomporre rapidamente la maggior parte delle proteine in frammenti più piccoli.
A cosa serve la proteinasi K?
La proteinasi K è diventata un reagente essenziale per la ricerca di biologia molecolare. Ecco alcuni dei suoi usi più comuni:
Digerire le proteine contaminanti
Quando si isola DNA o RNA da cellule e tessuti, la proteinasi K viene utilizzata per digerire le proteine contaminanti. Ciò rimuove le impurità dai preparati di acidi nucleici. Aggiunta di detersivi come Scheda di sicurezza aiuta a esporre le proteine per una migliore digestione.
Inattivazione delle nucleasi
Molte nucleasi che possono degradare il DNA e l'RNA sono esse stesse proteine. La proteinasi K inattiva rapidamente queste nucleasi dannose mediante scissione proteolitica. Ciò protegge gli acidi nucleici isolati dalla degradazione.
Digestione dei tessuti
La proteinasi K può aiutare a dissociare le cellule e solubilizzare i tessuti, rilasciando acidi nucleici per l'estrazione. È incluso nei tamponi di lisi dei tessuti per i protocolli di purificazione del DNA/RNA.
Analisi delle proteine
La proteasi produce frammenti peptidici specifici che forniscono informazioni sulla struttura della proteina. I modelli di digestione della proteinasi K sono utili per studiare i domini proteici, siti di modifica, eccetera.
Inattivazione dei prioni infettivi
Come endopeptidasi, la proteinasi K può digerire le proteine prioniche mal ripiegate responsabili delle encefalopatie spongiformi trasmissibili come la malattia di Creutzfeldt-Jakob. È usato per inattivare la contaminazione da prioni.
Sequenziamento del DNA
Alcuni metodi di sequenziamento del DNA utilizzano la proteinasi K per rimuovere la DNA polimerasi dopo l'estensione della sequenza, preparazione del DNA per l'elettroforesi.
Ibridazione in situ
L'enzima può permeabilizzare delicatamente cellule/tessuti fissi per l'ibridazione di sonde nucleotidiche preservando l'integrità dell'RNA e del DNA.
Quali condizioni richiede la proteinasi K?
Di seguito sono riportate le condizioni necessarie alla proteinasi K per funzionare correttamente.
Temperatura
La proteinasi K mostra un'elevata attività da 50°C a 65°C, con una temperatura ottimale di circa 60°C. Conserva una certa capacità proteolitica anche a 37°C. Le temperature più elevate probabilmente rendono le strutture proteiche più accessibili.
pH
Questo enzima funziona in un ampio intervallo di pH dal pH 4 al pH 12, con attività massima tra il pH 7.5 E 12. Le condizioni alcaline sono le migliori, ma va bene anche il pH neutro.
Detersivi
Aggiunta di detergenti ionici come SDS (sodio dodecil solfato) può migliorare l’attività della proteinasi K denaturando i substrati proteici. Detersivi non ionici come Tritone X-100 anche lavorare.
Cationi bivalenti
La proteinasi K richiede ioni calcio per la piena attività enzimatica e stabilità. L'EDTA chela il calcio e può inibire l'enzima. Tuttavia, la proteinasi K mantiene ancora alcune funzioni senza calcio.
Come viene utilizzata la proteinasi K in laboratorio?
La proteinasi K ha importanti funzioni in laboratorio e viene utilizzata in laboratorio nei seguenti modi:
Ricetta tampone per la proteinasi K
Contiene un tipico tampone di digestione della proteinasi K:
- 10 mm Tris-HCl pH 8.0
- 100 mM NaCl
- 5% Scheda di sicurezza
- 50 μg/mL di proteinasi K
Il Tris mantiene un pH alcalino intorno 8.0. NaCl fornisce una certa forza ionica. L'SDS denatura le proteine per la digestione. Il buffer può essere modificato secondo necessità.
Protocollo di digestione
- Aggiungere la proteinasi K al tampone appena prima dell'uso.
- Incubare i campioni nel tampone per 30 min a 2 ore a una temperatura compresa tra 50°C e 65°C.
- Inattivare la proteinasi K riscaldando a 95°C per 10 min o utilizzando PMSF.
Digest più lunghi o una temperatura più elevata possono aumentare l'attività. Il contesto campione detta le condizioni ottimali.
Attenzione!
La proteinasi K è una proteasi molto potente. È necessario prestare attenzione per evitare di contaminare i campioni o di degradare le proteine destinate ad essere analizzate. Indossare sempre guanti e utilizzare forniture dedicate.
Come viene inattivata la proteinasi K?
Una volta che la proteinasi K ha raggiunto il suo scopo, deve essere inattivato per fermare l'ulteriore digestione. Ecco alcuni metodi:
- Riscaldamento: Temperature superiori a 90°C inattivano rapidamente l'enzima. Tuttavia, il riscaldamento non elimina completamente l'attività residua.
- PMSF: Questo inibitore irreversibile della serina proteasi modifica covalentemente la serina catalitica, bloccando permanentemente l'attività.
- AEBSF: Un altro inibitore della serina proteasi che inattiva permanentemente la proteinasi K.
- TCA: L'acido tricloroacetico denatura e precipita l'enzima.
Il riscaldamento è il metodo più conveniente, ma gli inibitori della serina proteasi forniscono un'inattivazione completa.
Quali sono alcune alternative alla proteinasi K?
Alcune alternative alla proteinasi K includono:
- Pronaso: Una miscela di proteasi non specifica isolata da Streptomyces griseus.
- Tripsina: Una serina proteasi con specificità per lisina e arginina.
- Pepsina: Una proteasi aspartica dal succo gastrico dei mammiferi. Funziona meglio in condizioni acide.
- Papaina: Una proteasi cisteina della papaia. Spesso utilizzato per la dissociazione cellulare.
Ciascuno ha una certa sovrapposizione con la proteinasi K nella degradazione delle proteine, ma le loro proprietà specifiche differiscono. La proteinasi K è ancora la più utilizzata per scopi di laboratorio generali.
Conclusione
La potente serina proteasi proteinasi K è indispensabile per la ricerca e la diagnostica in biologia molecolare. La sua notevole capacità di digerire rapidamente le proteine pur rimanendo attiva in condizioni difficili lo rende l'enzima di riferimento per rimuovere le proteine contaminanti e proteggere gli acidi nucleici.
Capire cos'è la proteinasi K, come funziona, e le sue condizioni di lavoro ottimali consentono ai ricercatori di sfruttare tutto il suo potenziale in laboratorio. Questa versatile proteasi continua a consentire innumerevoli tecniche eliminando le proteine interferenti e inattivando le nucleasi dannose per recuperare DNA e RNA della massima purezza.
