Cos'è la PCR-SSCP? Le applicazioni e la guida completa

Con lo sviluppo delle tecniche di biologia molecolare, sono emersi continuamente vari metodi per rilevare strutture e mutazioni genetiche. Soprattutto dopo l'avvento di PCR tecnologia, varie tecniche di rilevamento genetico combinate con la PCR hanno ulteriormente spinto il progresso della ricerca genetica. Tecniche come il sequenziamento diretto di prodotti PCR asimmetrici, scissione della ribonucleasi (RNAsi), e analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) sono diventati potenti strumenti per l’analisi genetica. Tuttavia, questi metodi sono relativamente complicati da utilizzare, presentano limitazioni significative, o richiedono condizioni sperimentali elevate, rendendoli inadatti ai laboratori clinici generali.

Introdotto nel 1989, PCR-SSCP (Polimorfismo di conformazione a filamento singolo) è stato sottoposto a continui miglioramenti e perfezionamenti, rendendolo più semplice, Più veloce, e un metodo più sensibile per rilevare le mutazioni genetiche. Non viene utilizzato solo per rilevare mutazioni puntiformi e delezioni e inserzioni di brevi sequenze, ma viene utilizzato anche nella quantificazione del DNA, monitoraggio della contaminazione crociata negli esperimenti diagnostici PCR, e indagare sulle fonti di infezione. Grazie agli eccezionali vantaggi di SSCP, è stato ampiamente applicato negli ultimi anni.

Principi e caratteristiche della SSCP

• Scoperta e concetto di base:
  • DNA a filamento singolo (ssDNA) i frammenti mostrano complesse conformazioni di piegamento spaziale mantenute da interazioni intramolecolari, principalmente accoppiamento di basi.
  • Un singolo cambiamento di base può alterare in modo significativo o lieve la conformazione spaziale, con conseguenti diversi modelli di migrazione nel gel di poliacrilammide.
• Meccanismo di separazione:
  • Elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante (PAGINA) può separare nettamente molecole di ssDNA con conformazioni diverse a causa dei diversi livelli di ostruzione nel gel.
• Analisi SSCP:
  • Chiamato polimorfismo di conformazione a filamento singolo (SSCP) dal ricercatore giapponese Orita e colleghi.
  • Applicato per rilevare mutazioni genetiche nei prodotti amplificati tramite PCR, valorizzando la semplicità e la sensibilità.
• Processo di base:
  1. Amplificazione PCR: Amplifica il DNA bersaglio.
  2. Denaturazione e Rinaturazione: Denaturare i prodotti PCR specifici e rinaturarli rapidamente per formare molecole di DNA a filamento singolo con strutture spaziali specifiche.
  3. PAGINA non denaturante: Eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante su una quantità adeguata di DNA a filamento singolo.
  4. Rilevamento: Analizzare i risultati utilizzando l'autoradiografia radiografica, colorazione argento, o colorazione con bromuro di etidio.
• Interpretazione:
  • Una variazione nel tasso di migrazione dello ssDNA rispetto al controllo normale indica un cambiamento nella conformazione, suggerendo una mutazione di base in quel frammento di DNA.
• Vantaggi:
  • Semplice, veloce, e metodo sensibile.
  • Non richiede attrezzature specializzate.
  • Adatto per laboratori clinici.
• Limitazioni:
  • Rileva solo le mutazioni; è necessario un ulteriore sequenziamento per individuare la posizione esatta e il tipo di mutazione.
  • Sono richieste condizioni elettroforetiche rigorose.
  • Possibili falsi negativi se le mutazioni puntiformi non alterano significativamente la conformazione dello ssDNA o se altre condizioni interferiscono.
• Efficienza di rilevamento:
  • Nonostante le limitazioni, SSCP vanta un tasso di rilevamento elevato rispetto ad altri metodi.
  • In grado di identificare mutazioni di base sconosciute all'interno del frammento di DNA bersaglio.
  • Takao ha dimostrato che SSCP può rilevare 90% di mutazioni a base singola in frammenti di DNA più corti di 300 p.b.
• Ulteriori applicazioni:
  • SSCP può separare l'ssDNA mutante con diverse velocità di migrazione attraverso l'elettroforesi su gel di poliacrilammide.
  • Consente un'ulteriore purificazione e identificazione dei frammenti di DNA mutante a livello di sequenza.

Sviluppo e miglioramenti del SSCP

• Sviluppo iniziale:
  • Inizialmente, La SSCP prevedeva l'incorporazione di isotopi nei prodotti di amplificazione della PCR, e i risultati sono stati visualizzati tramite autoradiografia. Ciò ha posto sfide per un’adozione diffusa.
• Semplificazione:
  • La combinazione della colorazione con argento del DNA con PCR-SSCP, in particolare l'applicazione della colorazione diretta con bromuro di etidio, ha notevolmente semplificato il metodo.
• Recenti miglioramenti degni di nota:
  • Analisi RNA-SSCP:
    • Il principio fondamentale: L'RNA ha conformazioni secondarie e terziarie più complesse, rendendolo altamente sensibile alle mutazioni a base singola, aumentando così i tassi di rilevamento.
    • Il tasso di rilevamento della mutazione può superare 90%.
    • L’RNA è meno incline a formare doppi filamenti, consentendo di utilizzare una quantità maggiore nell'elettroforesi, che è utile per la colorazione con bromuro di etidio.
    • Tuttavia, questo metodo aggiunge una fase di trascrizione inversa e richiede primer più lunghi contenenti sequenze del promotore della RNA polimerasi, crescente complessità.
• Combinazione di SSCP con altri metodi di rilevamento delle mutazioni:
  • Analisi eteroduplex (Esso):
    • Migliora significativamente i tassi di rilevamento se combinato con SSCP.
    • Implica l'ibridazione di una sonda con lo ssDNA o l'RNA bersaglio. I filamenti ibridi contenenti una coppia di basi non corrispondenti possono essere separati da filamenti ibridi completamente complementari mediante elettroforesi in gel PAG non denaturante.
    • L'esecuzione sia dell'analisi SSCP che dell'analisi Het sulla stessa sequenza target può raggiungere risultati prossimi 100% tasso di rilevamento delle mutazioni puntiformi, pur mantenendo la semplicità sperimentale.

La Procedura PCR-SSCP

Preparazione del gel basata sulla lunghezza del frammento di DNA

Per frammenti di DNA inferiori a 1Kb, scegliere la concentrazione del gel di poliacrilammide come segue:

• Lunghezza del frammento di DNA (p.b): % Concentrazione di acrilammide
  • 1Kb-700b: 3.5%
  • 700b–500b: 5%
  • 500b–200b: 8%
  • 200B: 12%

Preparativi pre-SSCP

• Amplificazione PCR: Amplifica un prodotto specifico con minime sbavature (confermato mediante elettroforesi su gel di agarosio).

1. Preparazione del gel di poliacrilammide (PAG)

• Preparare la soluzione gel in base alla concentrazione richiesta dalla tabella sopra.
• Inserisci un pettine nello stampo del gel.
• Versare la soluzione gel da un'estremità del pettine, inclinando lo stampo verso l'estremità di colata man mano che il gel raggiunge i denti del pettine per evitare la formazione di bolle.
• Lasciare solidificare il gel a temperatura ambiente 1 ora.
• Rimuovere il pettine e aggiungere 1 tampone TBE sopra il gel per coprirlo.

2. Elettroforesi

1. Prendere 10 μl di prodotto della PCR.
2. Aggiungere 10 ml di agente denaturante (95% formammide, 10 mmol/l EDTA, 0.02% blu di bromofenolo).
3. Aggiungere 30 ml di olio minerale.
4. Bollire per 5 minuti, quindi metterlo immediatamente in un bagno di ghiaccio per almeno 2 minuti.
5. Caricare l'intera fase acquosa sul gel.
6. Eseguire l'elettroforesi a 10-15°C:
   • Inizia con 300 V per 5 minuti.
   • Continuare con 120 V per 8 ore.
7. Dopo l'elettroforesi, colorare il gel in tampone 1×TBE contenente 0.5 μg/ml bromuro di etidio per 30-45 minuti.
8. Osservare alla luce UV o procedere alla colorazione con argento.

3. Colorazione argento

1. Lavare il PAG due volte con acqua deionizzata.
2. Fissare il gel in una soluzione di 10% etanolo e 0.5% acido acetico per 6 minuti.
3. Lavare due volte con acqua deionizzata.
4. Immergiti 0.2% nitrato d'argento (AgNO3) soluzione per 10 minuti.
5. Lavare 3-5 volte con acqua deionizzata.
6. Sviluppare in una soluzione di 1.5% idrossido di sodio (NaOH) E 0.4% formaldeide per 7 minuti.
7. Interrompi lo sviluppo con 0.75% carbonato di sodio (NaCO3).

Applicazioni della SSCP

Poiché Orita e colleghi hanno utilizzato SSCP per l'analisi del polimorfismo del DNA umano, il metodo è stato ampiamente impiegato in vari campi, compreso il rilevamento di mutazioni genetiche associate al cancro e alle malattie ereditarie, così come nella tipizzazione dei virus e nel monitoraggio della contaminazione.

Rilevazione della mutazione del gene del cancro

• Mutazioni associate al tumore:
  • La SSCP è ampiamente utilizzata per rilevare mutazioni nei geni correlati a vari tumori come l'astrocitoma, tumori al cervello, cancro del polmone a piccole cellule, cancro gastrico, e cancro del colon-retto.
  • È stato applicato per rilevare mutazioni nel gene P53 in questi tumori e mutazioni del gene ras nel cancro del polmone.
• Applicazioni di successo:
  • Recentemente, Sugano et al. ha utilizzato con successo SSCP colorato con argento per rilevare una mutazione in posizione 12 del gene c-Ki-ras2, completando il processo di elettroforesi e colorazione all'interno 2.5 ore.

Ricerca sulle malattie ereditarie

• SSCP è utilizzato nello studio dei geni coinvolti nelle malattie ereditarie come:
  • Fibrosi cistica: Rilevazione di mutazioni nel gene CFTR.
  • Tipo di neurofibromatosi 1: Analisi delle mutazioni genetiche.
  • Poliposi adenomatosa familiare: Ricerca genetica relativa a questa condizione.
• RNA-SSCP vs. DNA-SSCP:
  • Sharkar et al. utilizzato RNA-SSCP per rilevare sequenze genetiche in 28 pazienti affetti da emofilia B.
  • Rivelato il confronto con DNA-SSCP e il sequenziamento diretto del gene 20 mutazioni base nel gene del fattore IX da 2,6 kb, con rilevamento RNA-SSCP 70% di queste mutazioni rispetto a 35% rilevato dal DNA-SSCP, dimostrando una maggiore sensibilità di RNA-SSCP.

Tipizzazione dei virus e monitoraggio della contaminazione

• Digitazione dei virus:
  • SSCP viene utilizzato per la tipizzazione dei virus e il monitoraggio della contaminazione negli esperimenti PCR.
  • YaP ha utilizzato la PCR annidata per rilevare campioni di HBV provenienti da diverse regioni, seguita dall'analisi SSCP, che ha rivelato modelli SSCP distinti per ciascun campione, indicando variazioni regionali nel DNA dell'HBV ed eliminando la possibilità di contaminazione incrociata.
• Monitoraggio della contaminazione:
  • SSCP funge da metodo affidabile per garantire l'accuratezza dei risultati diagnostici della PCR.

Studi sulla trasmissione degli agenti patogeni

• SSCP viene utilizzato per studiare le vie di trasmissione degli agenti patogeni.

Analisi quantitativa del DNA

• Analisi delle cellule del cancro al seno:
  • SSCP, combinato con PCR competitiva, è stato utilizzato per l'analisi quantitativa dei geni mutanti P53 nelle cellule di cancro al seno.
  • Il vantaggio del metodo risiede nell’uso di standard interni che differiscono dal DNA target solo per una base, garantendo condizioni di amplificazione identiche e quindi una quantificazione del DNA più accurata.

Precauzioni per la SSCP

SSCP è un rapido, semplice, e un metodo sensibile per rilevare le mutazioni genetiche. Per ottenere risultati ottimali, è necessario osservare le seguenti precauzioni:

Ripetibilità:

• I principali fattori che influenzano la ripetibilità dell'SSCP sono la tensione e la temperatura dell'elettroforesi. Mantenere costanti queste condizioni garantisce una buona ripetibilità dei modelli SSCP.
• Generalmente, I modelli SSCP mostrano due bande di DNA a filamento singolo, ma a volte possono apparire solo una o più di tre bande a causa di conformazioni spaziali simili tra due molecole di DNA a filamento singolo. La presenza di più di tre bande può indicare una miscela di frammenti di DNA wild-type e mutanti.

Impatto della lunghezza della sequenza di DNA target:

• SSCP è più efficace nel rilevare mutazioni puntiformi in sequenze di DNA o RNA più brevi rispetto a quelle più lunghe. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che i cambiamenti di una singola base nelle molecole più lunghe hanno un impatto minore sul mantenimento della conformazione spaziale.
• Alcuni ricercatori ritengono che le catene del DNA siano più corte di 400 p.b, la durata non pregiudica l’efficacia del SSCP. Un'attenta selezione delle condizioni sperimentali può raggiungere un tasso di rilevamento superiore 90% per mutazioni puntiformi in 354 bp frammenti di DNA.

Tensione e temperatura dell'elettroforesi:

• Mantenere le conformazioni spaziali stabili del DNA a filamento singolo, La SSCP dovrebbe essere condotta a temperature più basse (tipicamente tra 4°C e 15°C). Alta tensione all'inizio (250V) per 5 minuti aiuta a separare inizialmente il DNA a filamento singolo con conformazioni diverse senza aumentare significativamente la temperatura del gel. Questo dovrebbe essere seguito da una tensione più bassa (circa 100V) per separare ulteriormente i fili.
• La tensione esatta per l'elettroforesi deve essere determinata in base a condizioni sperimentali specifiche.

Impatto della posizione di mutazione puntiforme:

• La posizione di una mutazione puntiforme nel DNA o nell'RNA influisce sui tassi di rilevamento della SSCP in base al suo ruolo nel mantenimento della conformazione spaziale, piuttosto che la sua posizione lineare sulla catena.
• Le mutazioni nella regione centrale del DNA sono generalmente più facili da rilevare rispetto a quelle vicine alle estremità.
• Tuttavia, anche le mutazioni nella regione centrale possono passare inosservate se non alterano significativamente la conformazione spaziale. Ad esempio, Lo studio di White ha scoperto solo questo 2 fuori da 9 sono stati rilevati campioni con mutazioni puntiformi nell'ansa di una struttura a forcina, indicando un tasso di rilevamento di 22%.

Interpretazione dei risultati SSCP:

• SSCP separa il DNA a filamento singolo in base alla conformazione spaziale piuttosto che al peso molecolare o alla carica. A volte, i tassi di migrazione delle catene normali e mutanti sono molto vicini, rendendo difficile distinguerli.
• Tipicamente, lunghezze dell'elettroforesi di 16-18 cm sono necessari per determinare con precisione i risultati in base al limite di rilevamento, che è la più piccola differenza di distanza elettroforetica percepibile tra i frammenti di DNA mutanti e normali.
• Se la distanza è maggiore del limite di rilevamento (per esempio., 3mm), è indicata una mutazione. Una distanza minore non suggerisce alcun cambiamento. L'impostazione di un limite di rilevamento basso può portare a falsi positivi.
• Altre condizioni, come la quantità di prodotto PCR caricato, il grado di reticolazione del PAG, e concentrazione del gel, dovrebbero essere selezionati in base a specifici requisiti sperimentali.

Dettagli di PCR-SSCP per passaggi

Preparazione del campione

1. Amplificazione e rilevamento PCR:
   • Eseguire l'amplificazione PCR utilizzando primer appropriati e selezionare la temperatura di ricottura adatta.
   • Rilevare i prodotti di amplificazione eseguendoli su a 2-2.5% gel di agarosio mediante elettroforesi orizzontale. Carico 3-5 µl del prodotto della PCR.
   • La concentrazione ottimale del prodotto PCR dovrebbe essere intorno 10 ng/µl.
2. Miscelazione del prodotto PCR con tampone denatura:
   • Aggiungere 5 µl di tampone campione SSCP (tampone denaturazione, Come il buffer di sequenziamento in “Clonazione molecolare”) sul fondo di un tubo PCR pulito.
   • Aggiungi il prodotto di amplificazione PCR al centro del buffer. Regola l'importo in base alla visibilità della banda sul gel di agarosio:
     • Se la band è luminosa, aggiungere 1 ml.
     • Se il risultato è eccellente, aggiungere 0.5 ml.
     • Se la band non è molto chiara, aggiungere 1.5, 2, O 3 µl di conseguenza.
   • Aumentare la quantità di tampone del campione proporzionalmente, per esempio., per 3 µl di prodotto PCR, aggiungere 8 µl di tampone per una migliore denaturazione.
3. Denaturazione del prodotto PCR:
   • Centrifuga il tubo per concentrare il campione nella parte inferiore.
   • Denatura il campione a 95 ° C per 10 minuti usando a Macchina per PCR, quindi posizionare immediatamente il prodotto PCR sul ghiaccio per 5 minuti per prevenire la rinaturazione.

   Nota: Passi 3 E 4 può essere eseguita dopo la quarta fase di preparazione del gel in attesa che il gel si solidifichi.

Preparazione del gel

1. Preparazione delle lastre di vetro:
   • Sciacquare ogni coppia di lastre di vetro con acqua di rubinetto seguita da ddH2O.
   • Asciugare le lastre di vetro con carta assorbente e poi asciugarle con etanolo anidro.
   • Lasciare evaporare l'etanolo 2-3 minuti.
   • Assembla le lastre di vetro e posizionale nel supporto per la colata del gel, assicurandosi che entrambi i lati e il fondo siano fissati.
   • Stringere le viti di montaggio per mantenere le piastre a livello. (Verificare la presenza di perdite utilizzando etanolo anidro.)

Gel di grandi dimensioni (50% Concentrazione di glicerolo)

Piccoli gel (50% Concentrazione di glicerolo)

Versamento del gel

1. Miscelazione del gel: Dopo aver preparato la soluzione gel secondo la formulazione fornita, mescolare accuratamente per garantire l'uniformità.
2. Versare in piastre di vetro: Versare con attenzione la soluzione gel preparata nelle lastre di vetro assemblate. Assicurarsi che durante il processo di colata non rimangano bolle d'aria. Se si osservano bolle, Inclinare delicatamente le piastre per consentire alle bolle di salire in superficie. Picchiettare leggermente i lati delle piastre può aiutare a rilasciare le bolle d'aria intrappolate.
3. Inserimento del pettine: Una volta che il livello della soluzione gel raggiunge circa 0,5 cm sotto il bordo superiore delle lastre di vetro, inserire il pettine nel gel. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate tra i denti del pettine e la superficie del gel. Se sono presenti bolle, rimuovere il pettine, rilasciare le bolle, e reinserire il pettine con attenzione.
4. Permettere la polimerizzazione del gel: Dopo aver inserito il pettine, consentire al gel di polimerizzare posizionando le piastre piatte o leggermente inclinate (meno di 10 gradi) su una superficie piana per circa 30 minuti. Durante questo periodo, il gel polimerizzerà e solidificherà.

Nota: Questo è anche il momento adatto per procedere con la denaturazione dei campioni PCR come descritto nei passaggi 3 E 4 della prima sezione.

Caricamento del gel

• Posizionamento del gel:
  • Rimuovere il pettine dal gel subito dopo la polimerizzazione.
  • Assicurarsi che venga applicata una forza uniforme per mantenere l'integrità dei pozzetti.
  • Fissare la piastra di gel sull'apparecchio per elettroforesi con il lato del pozzetto rivolto verso l'interno.
  • Trasferire lentamente la piastra di gel sul tampone di elettroforesi per evitare grandi bolle d'aria.
• Pre-elettroforesi:
  • Aggiungere 1 tampone per elettroforesi TBE al serbatoio superiore fino a quando il livello del liquido è circa 1 cm sopra il bordo più corto della lastra di vetro.
  • Assicurarsi che non vi siano perdite dal serbatoio superiore.
  • Impostare la tensione su 140-150V per gli apparecchi grandi e 110-120V per gli apparecchi piccoli.
  • Pre-elettroforesi per circa 10 minuti.
• Caricamento del campione:
  • Aggiungere in sequenza i campioni preparati nei pozzetti del gel utilizzando una microsiringa.
  • Evitare di caricare i campioni nei due pozzetti più vicini ai bordi di ciascuna piastra di gel.
• Elettroforesi:
  • Impostare la tensione su 140-150V per gli apparecchi grandi e 110-120V per gli apparecchi piccoli.
  • Eseguire l'elettroforesi a una temperatura di 10-15°C per un minimo di 10 ore.

Colorazione

• Fissazione:
  • Rimuovere il gel dall'apparecchio, segnare il punto di partenza, e immergilo 70% etanolo per 15 minuti su uno shaker.
  • Recuperare l'etanolo dopo la fissazione e sciacquare due volte con acqua distillata per circa 3 minuti per risciacquo.
• Colorazione:
  • Colora il gel nella soluzione colorante (200ml contenente 3.6% NaOH 4,2 ml, 20% AgNO3 3,6 ml, ammoniaca 2 ml) per 30 minuti.
  • Regolare il tempo di colorazione se si colorano due gel contemporaneamente.
• Sviluppo:
  • Sviluppare il gel nella soluzione di sviluppo (200ml contenente 1% citrato di sodio 1 ml, formaldeide 100ul) fino a quando le bande saranno chiaramente visibili.
  • Sciacquare tre volte con acqua distillata per 3 minuti ciascuno per fermare lo sviluppo.
  • In alternativa, colorare il gel immergendolo in tampone TBE 1× contenente 0,5 ug/ml di bromuro di etidio per 10 minuti e visualizzare sotto la luce ultravioletta

Formule

10×Formula TBE:

• Base Tris: 108G
• Acido borico: 55G
• 0.5mol/l EDTA (pH 8.0), volume regolato su 1 litro

Formula tampone denaturante:

• 98% Formammide deionizzata
• 10mmol/l EDTA (pH 8.0)
• 0.025% Xilene Cianolo FF
• 0.025% Blu di bromofenolo

Appunti:

1. Riproducibilità:
   • Il mantenimento di tensione e temperatura stabili durante l'elettroforesi è il fattore principale che influenza la riproducibilità dell'SSCP.
   • Tipicamente, I modelli SSCP mostrano due bande di DNA a filamento singolo, ma a volte possono apparire solo una o tre o più bande, probabilmente a causa della presenza di conformazioni tridimensionali simili tra frammenti di DNA wild-type e mutanti.
2. Influenza della lunghezza della sequenza di DNA target:
   • SSCP ha un tasso di rilevamento più elevato per le mutazioni puntiformi nel DNA o nell'RNA a catena corta rispetto al DNA a catena lunga. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che i cambiamenti delle basi individuali nelle molecole di DNA e RNA a catena lunga hanno un effetto minore sul mantenimento delle conformazioni tridimensionali.
   • Nel caso di catene di DNA più corte (inferiore a 400 pb), la lunghezza del DNA non influisce sull'efficacia del SSCP.
3. Effetti della tensione e della temperatura dell'elettroforesi:
   • Mantenere una conformazione tridimensionale stabile del DNA a filamento singolo, La SSCP deve essere eseguita a una temperatura più bassa (generalmente tra 4°C e 15°C).
   • Durante l'elettroforesi, una tensione eccessiva può causare un aumento della temperatura. Perciò, quando si esegue SSCP in una vasca per elettroforesi senza dispositivo di raffreddamento, una tensione più elevata (250V) dovrebbe essere usato inizialmente, seguita da una riduzione a circa 100 V per l'elettroforesi.
4. Interpretazione dei risultati SSCP:
   • Nell'analisi SSCP, la separazione dei frammenti di DNA a filamento singolo si basa sulla dimensione del loro ostacolo sterico piuttosto che sul peso molecolare, quindi incapace di riflettere il peso molecolare.
   • L'interpretazione dei risultati dovrebbe basarsi sul limite di rilevamento, che si riferisce alla differenza minima nella distanza elettroforetica tra i frammenti di DNA mutanti e normali che possono essere distinti.
5. Altre considerazioni:
   • Condizioni come la quantità di prodotto PCR caricato, la densità di reticolazione del gel di poliacrilammide, e la concentrazione del gel dovrebbe essere selezionata e determinata in base a specifiche condizioni sperimentali.