Cos'è la PCR in situ? A cosa serve?

In loco PCR, o reazione a catena della polimerasi in situ, è una tecnica utilizzata nella ricerca scientifica. Ogni nuova tecnologia sviluppata nella scienza produce una serie di nuovi risultati di ricerca, guidando così il progresso di varie discipline.

Lo sviluppo della PCR in situ

• Negli anni '50, L'introduzione della microscopia elettronica nell'osservazione morfologica ha provocato ricerche approfondite dal livello cellulare a livello subcellulare.
• Negli anni '60 e '70, L'applicazione diffusa delle tecniche di immunoistochimica e immunocitochimica ha spinto l'osservazione dalle strutture subcellulari al livello delle molecole proteiche, consentendo la localizzazione di numerose sostanze attive all'interno delle cellule o a livello subcellulare, influire profondamente allo sviluppo della biologia medica.
• Negli anni '70, L'ampia applicazione delle tecniche di biologia molecolare in morfologia, insieme all'emergere della tecnologia di ibridazione in situ, abilitato la localizzazione di specifiche sequenze di DNA o RNA all'interno delle cellule tissutali, Aumentare il livello di osservazione e localizzazione dalle proteine ​​a livello genetico, vale a dire molecole di acido nucleico. Questa approfondita la comprensione umana di molti fenomeni biologici a livello genetico.
• Negli anni '80, PCR (Reazione a catena della polimerasi), Una tecnica robusta vitale nel campo della biologia molecolare, è emerso. Fu rapidamente introdotto nel campo dell'osservazione morfologica, Abilitare la localizzazione e l'osservazione di DNA o RNA specifici con numeri di copia bassi o singole copie all'interno delle cellule. L'avvento di questa tecnica è destinato a produrre ulteriori risultati di ricerca, spingere gli studi morfologici in avanti con un passo significativo.

I principi della PCR in situ

• Principio di base: La PCR in situ combina l'amplificazione ad alta efficienza della PCR con la localizzazione cellulare dell'ibridazione in situ per rilevare sequenze specifiche del DNA o dell'RNA all'interno delle cellule tissutali.
• Tecnica PCR: Utilizza DNA polimerasi per amplificare sequenze target specifiche attraverso la denaturazione, ricottura, e cicli di estensione, con conseguente amplificazione altamente sensibile e specifica.
• Limitazioni della PCR tradizionale: La PCR tradizionale è condotta in una fase liquida, richiedere l'interruzione cellulare e l'estrazione dell'acido nucleico prima dell'amplificazione, rendendo difficile correlare i risultati della PCR con la morfologia cellulare e identificare i tipi di cellule contenenti sequenze target specifiche.
• Vantaggi della PCR in situ: Combina i punti di forza della PCR e delle tecniche di ibridazione in situ e superando le rispettive limitazioni.
• Procedura: I campioni di tessuto sono fissi chimicamente per mantenere la morfologia cellulare. La permeabilità delle membrane cellulari e nucleari consente ai componenti della PCR di entrare in cellule o nuclei, dove amplificano l'RNA o il DNA fisso in situ. Prodotti amplificati, tipicamente molecole o strutture intrecciate, vengono mantenuti in situ e facilmente rilevati mediante ibridazione in situ.
• Benefici: Abilita l'amplificazione esponenziale di specifiche sequenze di DNA o RNA all'interno delle cellule, facilitando il loro rilevamento tramite ibridazione in situ.

Tipi di base di PCR in situ

Le tecniche PCR in situ possono essere classificate in due tipi principali: Metodo diretto e metodo indiretto, in base al fatto che i nucleotidi o i primer trifosfato utilizzati nella reazione di amplificazione siano etichettati. Inoltre, c'è la tecnica PCR trascrizione inversa in situ.

Metodo diretto in situ PCR tecnica:

• Nel metodo diretto, I prodotti di amplificazione sono direttamente etichettati con molecole di marker, come frammenti di adenosina trifosfato o di primer etichettati. Durante l'amplificazione PCR del campione, Le molecole etichettate sono incorporate nei prodotti amplificati, Abilitare la visualizzazione di DNA o RNA specifico nel campione (in loco).
• I marcatori comuni includono isotopi radioattivi come 35s, biotina, e digossigenina. Questi marcatori’ Le posizioni possono essere rilevate utilizzando metodi come l'autoradiografia per isotopi radioattivi o chimica dei tessuti di affinità e immunoistochimica per biotina e digossigenina.
• I vantaggi del metodo diretto includono semplicità, tempi di elaborazione più brevi, e facilità di funzionamento. Tuttavia, ha svantaggi come una specificità inferiore, maggiore probabilità di falsi positivi, e una minore efficienza di amplificazione, Soprattutto nelle sezioni di paraffina in cui il danno al DNA durante il sezionamento può portare a falsi positivi.
• Metodo indiretto nella tecnica PCR in situ:

Metodo indiretto nella tecnica PCR in situ:

• Nel metodo indiretto, L'amplificazione specifica del DNA o dell'RNA viene eseguita per la prima volta all'interno delle cellule, seguito dall'ibridazione in situ usando sonde marcate, Migliorare significativamente la specificità. Attualmente è la tecnica PCR in situ più utilizzata.
• A differenza del metodo diretto, Il sistema di reazione è simile alla PCR convenzionale, senza primer marcati o adenosina trifosfato utilizzata. Lo scopo è amplificare prima, Quindi rilevare i prodotti specifici del DNA amplificati all'interno delle cellule utilizzando la tecnologia di ibridazione in situ. Combina efficacemente le tecniche di ibridazione PCR e in situ, noto anche come ibridazione in situ PCR (Pastella).
• I vantaggi del metodo indiretto includono una maggiore specificità e efficienza di amplificazione, Ma comporta passaggi operativi più complessi rispetto al metodo diretto.

Tecnica PCR trascrizione inversa in situ:

• Trascrizione inversa in situ PCR (In situ rt-pcr) è una nuova tecnica che applica la tecnologia RT-PCR in fase liquida ai campioni di cellule tissutali. A differenza della RT-PCR in fase liquida, I campioni di tessuto sono trattati con enzimi del DNA prima della PCR di trascrizione inversa in situ per distruggere il DNA tissutale, Garantire che il modello amplificato sia sintetizzato dal mRNA, non il DNA originale nelle cellule. Altri passaggi di base sono simili a RT-PCR in fase liquida.

Come eseguire test PCR in situ?

I passaggi di base della tecnologia PCR in situ includono la preparazione del campione, amplificazione in situ (PCR), e rilevamento in situ, come indicato di seguito (con particolare attenzione alle sezioni di paraffina):

Preparazione del campione:

• Le tecniche PCR in situ possono essere applicate alle sospensioni cellulari, stringi cellulari, sezioni congelate, e sezioni di paraffina.
• Rispetto ad altri metodi, La PCR in situ produce i migliori risultati con cellule intatte sospese, mentre le sezioni di paraffina producono i risultati più poveri.
• Alcuni motivi per scarse prestazioni includono:
  • Scarsa conducibilità termica e convezione di calore irregolare quando si conduce PCR su vetrini.
  • Adsorbimento dell'enzima DNA Taq in vetrini di vetro.
  • Dopo l'elaborazione del campione, Le cellule mancano di citoplasma intatto o membrane nucleari, portando alla diffusione di prodotti di amplificazione e difficoltà a mantenerli in situ.
• La maggior parte dei campioni di patologia sono fissati con formalina e conservati nella paraffina.
• Risolvere i problemi tecnici relativi alla PCR in situ nelle sezioni di paraffina sarebbe molto significativo.

Fissazione cellulare tissutale: Le cellule tissutali sono generalmente fissate con 10% formalina tamponata o 4% Paraformaldeide per risultati migliori in PCR in situ. Il tempo di fissazione non dovrebbe essere eccessivamente lungo, in genere 4-6 ore a 4 ° C..

Spessore fetta: Le fette più spesse generalmente producono migliori risultati in PCR in situ perché contengono più strutture di DNA e membrana target, prevenire la diffusione dei prodotti di amplificazione. Tuttavia, Fette più spesse possono portare a una maggiore sovrapposizione cellulare e una riduzione della risoluzione nell'osservazione morfologica.

Trattamento a diapositiva: Per prevenire il distacco di sezioni di paraffina durante la PCR e l'ibridazione in situ, Le vetrini devono essere trattate per prevenire il distacco. I metodi comuni includono il rivestimento con il trattamento di poli-L-lisina o silanizzazione, che generalmente impediscono il distacco dei tessuti.

Digestione proteica:

Amplificazione in situ (PCR): L'amplificazione in situ comporta la conduzione di reazioni PCR sui campioni di cellule tissutali, con il principio di base che è lo stesso di quello della PCR in fase liquida. I primer utilizzati in PCR sono generalmente 15-30 bp, e i frammenti amplificati sono di circa 100-1000 bp.

Sistema di reazione:

• Il sistema di reazione per la PCR in situ è ​​simile a quello della PCR in fase liquida convenzionale.
• Concentrazioni più elevate di primer, Taqdna polimerasi, e MG2+ sono suggeriti per migliori risultati di amplificazione su sezioni di tessuto fisso rispetto ai sistemi PCR in fase liquida.
• Albumina sierica bovina (BSA) dovrebbe essere aggiunto al sistema di reazione per impedire il legame di DNA polimerasi Taq.

Ciclismo termico:

• Il ciclo termico per PCR in situ può essere eseguito in un ciclista termico specializzato o in un ciclo termico normale.
• Ogni passo nel ciclo termico della PCR in situ può essere leggermente più lungo rispetto alla PCR convenzionale per garantire un'amplificazione adeguata.
• È possibile impiegare un metodo di avvio a caldo per ridurre al minimo la perdita del sistema di reazione durante il ciclo termico.

Lavaggio:

• Dopo l'amplificazione in situ, I campioni dovrebbero essere sottoposti a lavaggio per rimuovere i prodotti di amplificazione che si sono diffusi esterni.
• Il lavaggio inadeguato può portare alla visualizzazione dei prodotti di amplificazione durante il rilevamento, risultante in sfondi eccessivamente scuri o risultati falsi positivi.
• Il lavaggio eccessivo può anche comportare la rimozione di prodotti amplificati all'interno delle cellule, indebolire o perdere segnali positivi.

Post-fissa: Alcuni autori hanno riferito di usare 4% paraformaldeide per 2 ore o 2% glutaraldeide per 5 minuti per la post-fissa dopo l'amplificazione per garantire che i prodotti amplificati siano ben mantenuti nelle cellule durante il rilevamento, migliorando così la sensibilità e la specificità del rilevamento.

Rilevamento in situ: Il metodo per rilevare i prodotti di amplificazione della PCR in situ dipende dalla progettazione del protocollo PCR in situ. I metodi diretti rilevano direttamente i prodotti amplificati in base alla natura delle molecole etichettate, Mentre i metodi indiretti richiedono il rilevamento attraverso l'ibridazione in situ.

L'applicazione di PCR in situ

Rilevazione di geni esogeni

• Rilevazione di geni virali:
  • Nelle cellule infette da virus, Il rilevamento può essere impegnativo. Tuttavia, PCR in situ offre speranza nell'affrontare questa difficoltà.
  • La PCR in situ è ​​stata applicata con successo per osservare il ruolo di vari virus come l'HIV, HPV, HSV, HBV, HCV, eccetera., In condizioni come l'AIDS, tumori del sistema riproduttivo, epatite, e cancro al fegato, consentendo l'identificazione tempestiva di individui infetti.
• Rilevazione di geni batterici:
  • Un'applicazione di spicco è nel rilevamento della tubercolosi Mycobacterium. Quando le lesioni della tubercolosi sono atipiche, È difficile identificare i batteri al microscopio usando metodi di colorazione speciali. La PCR in situ può aiutare a fare una diagnosi definitiva, Anche quando la presenza di Mycobacterium tuberculosis è minima.
• Rilevazione di geni importati:
  • Nello studio degli animali transgenici, Conferma dell'importazione genica, così come nei pazienti sottoposti a terapia genica, può essere verificato usando PCR in situ. Così, La PCR in situ è ​​diventata un metodo di rilevamento importante.

Rilevazione di geni endogeni

Rilevazione di geni anormali:

• Rilevamento di mutazione e riarrangiamento:
  • La PCR in situ è ​​in grado di rilevare mutazioni e riarrangiamenti nei geni all'interno del corpo.
  • Mutazioni nei geni proto-oncogeni e soppressori del tumore, nonché riarrangiamenti dei geni della catena pesante dell'immunoglobulina, sono esempi di alterazioni genetiche rilevate usando PCR in situ.
• Applicazioni nella ricerca e nella diagnosi del cancro:
  • Queste mutazioni e riarrangiamenti svolgono ruoli cruciali nello sviluppo e nella progressione del cancro.
  • La PCR in situ offre ampie applicazioni nella ricerca e nella diagnosi del cancro consentendo la rilevazione precisa di queste alterazioni genetiche.
  • Facilita la comprensione dei meccanismi molecolari alla base del cancro e aiuti nello sviluppo di terapie mirate.

Rilevazione di geni costitutivi:

• Sfide dell'espressione genica di basso livello:
  • I geni costitutivi espressi a livelli bassi pongono sfide per i metodi di rilevamento.
  • Le tecniche di ibridazione in situ sono inefficaci a causa del numero limitato di copie geniche nelle cellule del corpo.
• Limitazioni della PCR in fase liquida:
  • La PCR in fase liquida può amplificare e rilevare geni di basso livello ma manca di specificità del tipo di cellula.
  • Non può determinare quale tipo di cellula contiene accuratamente il gene target.
• Vantaggi della PCR in situ:
  • La PCR in situ supera queste limitazioni.
  • Consente il rilevamento di vari geni umani, anche quelli espressi a livelli bassi.
  • La PCR in situ contribuisce al completamento della mappa genica umana fornendo una localizzazione genica accurata all'interno di tipi di cellule specifiche.