introduzione
- AFLP è una tecnologia di marker molecolare del DNA che rileva il polimorfismo del DNA limitando le lunghezze dei frammenti prodotti dalle endonucleasi di restrizione.
- Le caratteristiche principali della tecnica AFLP sono:
- Richiede una piccola quantità di DNA per l'analisi, Solo 0,5 g.
- Mostra una buona riproducibilità.
- Dimostra un forte polimorfismo.
- Offre un'alta risoluzione.
- Non richiede l'ibridazione meridionale.
- Adatto per una vasta gamma di campioni.
- Mostre ereditarietà stabile.
- In termini di caratteristiche tecniche, AFLP è un prodotto che combina RAPD e RFLP.
- Supera gli svantaggi della complessità e dei pericoli radioattivi della tecnologia RFLP, e l'instabilità e il dominio dei marcatori genetici in RAPD mentre incorporano i punti di forza di entrambi.
- Negli ultimi anni, Questa tecnologia è stata continuamente migliorata e sviluppata, Rendere AFLP diventa rapidamente il metodo molecolare più efficace fino ad oggi.
Il principio di AFLP
- AFLP è anche una tecnologia di marcatore molecolare del DNA che rileva il polimorfismo del DNA limitando le lunghezze dei frammenti prodotti dalle endonucleasi di restrizione.
- Tuttavia, AFLP prevede l'amplificazione dei frammenti tagliati all'enzima PCR Prima reazione, e quindi elettrofore i frammenti tagliati all'enzima amplificato su un gel di sequenziamento ad alta risoluzione. Il polimorfismo viene rilevato in base alle diverse lunghezze dei frammenti amplificati.
- Nell'esperimento, I frammenti tagliati agli enzimi sono prima legati a adattatori artificiali contenenti estremità coesive compatibili. La sequenza di queste estremità coesive, insieme alla sequenza dell'adattatore, funge da sito di legame per le successive reazioni PCR.
- A seconda dei requisiti, Primer diversi con 1 A 3 I nucleotidi selettivi aggiunti alle estremità possono essere utilizzati per ottenere un'amplificazione selettiva. Questi nucleotidi selettivi consentono ai primer di riconoscere selettivamente i frammenti tagliati agli enzimi con sequenze di accoppiamento specifiche, portando a un'amplificazione specifica.
Reagente usato nel test
| Reagenti sperimentali | Descrizione |
|---|---|
| Enzima taq | DNA polimerasi |
| Adattatori Ecori/MSEI | Adattatori di enzimi di restrizione |
| E+a primer | Primer per l'amplificazione PCR |
| Primer M+C. | Primer per l'amplificazione PCR |
| T4 DNA ligasi | Enzima ligasi del DNA |
| E e m oligonucleotidi | Oligonucleotidi per PCR |
| Agarosio | Matrice di gel per elettroforesi |
| Persolfato di ammonio | Catalizzatore per fusione in gel e denaturazione del DNA |
| Acrilamide | Componente della matrice in gel per sequenziamento ad alta risoluzione |
| Urea | Agente denaturante per l'elettroforesi |
| Nitrato d'argento | Macchia per visualizzare le bande di DNA |
| Formamide | Agente denaturante per gel di sequenziamento del DNA |
| dntps | Trifosfati di deossinucleotidi per PCR |
| Xilene cianolo | Tinking Dye per elettroforesi |
| Acido acetico | Utilizzato nella preparazione del gel |
| Silano in vetro | Agente di rivestimento per piastre di vetro in gel elettroforesi |
| 50BP Marks | Marcatore DNA di 50 coppie di base per riferimento alle dimensioni |
Procedura sperimentale
1. Estrazione e purificazione del DNA genomico
Fare riferimento ai metodi di estrazione del DNA.
- Elettroforesi di frammenti di DNA su a 0.8% gel di agarosio (contenente 0,5 μg/ml di bromuro di etidio, Eb), portare fuori 1/3 del DNA genomico estratto per la purificazione.
- In primo luogo, Ripristinare il volume del DNA estratto con tampone TE a un volume totale di 50 ml.
- Estratto una volta con fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (25:24:1) e una volta con cloroformio/alcol isoamilico (24:1). Centrifuga e trasferire il surnatante in un tubo Eppendorf.
- Aggiungere 1/10 volume di NAAC e il doppio del volume di etanolo assoluto pre-raffreddato, e posizionare almeno a -20 ° C per 2 ore. Centrifuga a 10.000 g per 10 minuti.
- Lavare due volte il precipitato del DNA 70% etanolo, aria asciutta, e dissolvi in 30 tampone μL TE.
- Misura i valori A260 e A280 usando un UV-2401pc (Shimadzu) Spettrofotometro UV per la quantificazione.
- Elettroforesi di frammenti di DNA su a 0.8% gel di agarosio (contenente 0,5 μg/ml EB) per la determinazione della dimensione.
Nota:
- Per tessuto 0,1-0,2 g, Sciogliere in una soluzione da 100 μl E. Per tessuto 0,5 g, Aumenta la soluzione da E a 300μL. A questo punto, La concentrazione di DNA è di circa 100 ng/μl.
2. Digestione e legatura degli enzimi di restrizione
In una provetta da 0,2 ml di centrifuga, aggiungere:
- Circa 250 ng di DNA,
- 2.5μl tampone digestione dell'enzima di restrizione 10 ×,
- 2.5μl tampone ligasi DNA 10 × T4,
- 5 Unità di Ecori,
- 5 Unità di MSEI,
- 2 Unità di T4 DNA ligasi,
- 50Adattatore Pmol MSEI,
- Acqua a doppia distillata a un volume totale di 25μl.
Incubare la miscela in un termociclatore PCR impostato a 37 ° C durante la notte. Dopo la digestione, inattivare gli enzimi incubando a 65 ° C per 20 minuti. Conservare la reazione a -20 ° C per un ulteriore utilizzo come modello di pre -amplificazione.
3. Pre-amplificazione
Prendi 3 μl del prodotto digerito e ligato enzimatico e aggiungi:
- 75di e+un primer,
- 75di primer M+C,
- 15mm mg2+,
- 25mm dntps,
- 1 unità di Taq polimerasi,
- 3μL di tampone 10 × PCR,
- Aggiungi acqua doppia distillata a un volume totale di 30μL.
Imposta i parametri di reazione PCR come segue:
- Denaturazione iniziale a 94 ° C per 90 secondi,
- Denaturazione a 94 ° C per 30 secondi,
- Ricottura a 56 ° C per 1 minuto,
- Estensione a 72 ° C per 1 minuto,
- Ripeti i passaggi precedenti per 30 cicli,
- Estensione finale a 72 ° C per 10 minuti (usando un Macchina per PCR dalla compagnia PE).
Dopo la reazione, analizzare i prodotti di amplificazione mediante elettroforesi su a 0.8% gel di agarosio (contenente 0,5 μg/ml EB). Prendi 3μl del prodotto e diluilo 50 Tempi per ulteriori utilizzo come modello per l'amplificazione selettiva.
4. Amplificazione PCR selettiva
Prendere 3μl del prodotto diluito e aggiungere:
- 75di Primer selettivo ECORⅰ,
- 75di di mseⅰ primer selettivo,
- 15mm mg2+,
- 25mm dntps,
- 1 Unità di taq polimerasi,
- 3μL di tampone 10 × PCR,
- Aggiungi acqua doppia distillata a un volume totale di 30μL.
Imposta i parametri di reazione PCR come segue:
- Denaturazione iniziale a 94 ° C per 90 secondi,
- Denaturazione a 94 ° C per 30 secondi,
- Ricottura a 65 ° C per 1 minuto, Quindi eseguire 13 cicli (diminuire la temperatura di 0,7 ° C per ciclo),
- Denaturazione a 94 ° C per 30 secondi,
- Ricottura a 56 ° C per 1 minuto,
- Estensione a 72 ° C per 1 minuto, Quindi eseguire 25 cicli,
- Estensione finale a 72 ° C per 5 minuti (Utilizzo di una macchina PCR da PE Company).
Primo, analizzare i prodotti di amplificazione selettiva mediante elettroforesi su a 0.8% gel di agarosio (contenente 0,5 μg/ml EB).
5. Elettroforesi in gel
Separare i prodotti amplificati utilizzando a 6% Gel di poliacrilammide denaturante (0.5spessore mm) e 1 × TBE tampone elettroforesi (Apparato di elettroforesi di sequenziamento bio-rad).
- Rimuovere il pettine e pre-corsa il gel a una potenza costante di 140 W per 30 minuti fino a quando la temperatura raggiunge i 47-49 ° C. Assicurati di lavare l'urea da ogni pozzo.
- Per i prodotti di amplificazione selettivi, Aggiungi un volume uguale di tampone di caricamento (98% formammide, 10MM EDTA, 0.25% xilene cianolo, 0.25% blu di bromofenolo) e denatura a 94 ° C per 5 minuti (Utilizzo di una macchina PCR da PE Company). Dopo la denaturazione, Posizionare rapidamente sul ghiaccio fino al caricamento.
- Carica 8μL di ciascun campione in ogni corsia. Inizialmente, eseguire il gel a una potenza costante di 100 W per circa 2 minuti per concentrare rapidamente i campioni nella parte inferiore dei pozzi. Quindi adattarsi a una potenza costante di 60W, mantenendo la temperatura di circa 43 ° C, Fino a quando il blu di bromofenolo raggiunge circa 2/3 Della distanza dalla parte superiore del gel alla lastra di vetro. Termina l'elettroforesi.
6. Colorazione argento
- Soluzione di fissazione: Aggiungi 100 ml di acido acetico glaciale a 900 ml di acqua deionizzata o acqua a due distorsi.
- Soluzione di colorazione: Dissolvere 1g Agno3 in 1L di acqua deionizzata, quindi aggiungi 1.5 ml di 37% formaldeide.
- Sviluppo di soluzione: Sciogliere 30G Na2Co3, 1.5 ml di 37% formaldeide, e 2 mg di tiosolfato di sodio in 1L di acqua deionizzata.
- Dopo l'elettroforesi, Posizionare la lastra di vetro con il gel in un vassoio di plastica per la colorazione d'argento.
- Fissazione: Aggiungi la soluzione di fissazione e scuoti delicatamente su uno shaker per 30 minuti. Riserva la soluzione di fissazione dopo la fissazione.
- Risciacquo: Lavare il gel tre volte con acqua deionizzata per 2 minuti ogni volta.
- Colorazione: Mettere il gel in un vassoio per colorare e versare la soluzione di colorazione (mantenuto a 4 ° C.). Scuotere delicatamente su uno shaker per 30 minuti. Dopo aver sciacquato il gel con acqua deionizzata per 10 secondi, Trasferiscilo nel vassoio in via di sviluppo.
- Sviluppo: Aggiungi la soluzione in via di sviluppo (mantenuto a 4 ° C.) e agitare delicatamente fino a quando le bande smettono di aumentare.
- Terminazione: Aggiungi la soluzione di fissazione usata dal passaggio 2 e agita per alcuni minuti. Risciacquare con acqua distillata per diversi minuti una volta ottenuti risultati ottimali.
- Dopo aver rimosso le goccioline d'acqua dal gel e dalla lastra di vetro, Posizionarlo su un Lightbox e fotografato utilizzando una fotocamera digitale Nikon.
Riepilogo
Grazie per aver fornito la procedura sperimentale AFLP completa! In caso di domande o hai bisogno di ulteriore assistenza, non esitate a chiederci. Siamo lieti di fornire supporto e risposte.
