Solarbio Superossido Dismutasi (ZOLLA ERBOSA) Kit di analisi dell'attività

Superossido dismutasi (ZOLLA ERBOSA) Kit di analisi dell'attività

Nota: È necessario prevedere 2-3 campioni con grandi differenze prima della determinazione formale.

Attrezzatura operativa: Spettrofotometro

Gatto n: BC0170

Misurare: 50T/24S

Componenti:

Reagente di estrazione: 60 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente ⅰ: 15 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente Ⅱ: 160 μL×1. Conservazione a 4 ℃. Miscelare pipettando dopo la centrifugazione.

Reagente Ⅲ: 11 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente Ⅳ: Polvere×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente V: 2 ml×1. Conservazione a 4 ℃. Aggiungere il Reagente Ⅳ al Reagente V prima dell'uso e agitare con un oscillatore per miscelare accuratamente. Può essere memorizzato 3 mesi.

Descrizione del prodotto:

Superossido dismutasi (ZOLLA ERBOSA, CE 1.15.1.1) è ampiamente presente negli animali, impianti, microrganismi e cellule in coltura. Catalizza l'anione superossido per formare H2O2 e O2. La SOD non è solo l'enzima che elimina l'anione superossido, ma anche il principale enzima produttore di H2O2, che svolge un ruolo importante nel sistema biologico antiossidante.

Anione superossido (O2-) è prodotto dal sistema di reazione xantina e xantina ossidasi. O2- può ridurre il tetrazolo blu per creare formazano blu, che ha potere assorbente 560 nm. La SOD può rimuovere l'O2- e inibiscono la formazione di metionina. Più scuro è il colore blu della soluzione di reazione, minore è l'attività della SOD. Più chiaro è il colore blu della soluzione di reazione, maggiore è l'attività della SOD.

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti:

Spettrofotometro, centrifuga da tavolo, pipetta di trasferimento, 1 Cuvetta di vetro da ml, mortaio/omogeneizzatore, ghiaccio e acqua distillata.

Fasi operative:

IO. preparazione del campione:

1. Batteri o cellule: raccogliere batteri o cellule nella provetta da centrifuga, eliminare il surnatante dopo la centrifugazione. Secondo la proporzione di batteri o cellule (104 cellule): volume della soluzione di estrazione (ml) Di 1:5-10 estrarre. Si suggerisce questo 5 milioni di batteri o cellule ammontano a 1 ml di reagente di estrazione. Dividere i batteri o le cellule con gli ultrasuoni (posto sul ghiaccio, potenza ultrasonica 200W o 20%, Tempo di lavoro 3s, intervallo 10s, ripetere per 30 volte). Centrifugare a 8000 ×g per 10 minuti a 4℃ per rimuovere materiali insolubili, e portare il surnatante sul ghiaccio prima del test.
2. Tessuto: in base alla proporzione del peso del tessuto (G): volume della soluzione di estrazione (ml) Di 1:5-10 estrarre. Si suggerisce questo 0.1 g di tessuto con 1 mL di reagente di estrazione e completamente omogeneizzato su ghiaccio.
3. Centrifugare a, 8000 ×g per 10 minuti a 4℃ per rimuovere materiali insolubili, e portare il surnatante sul ghiaccio prima del test.
4. Siero (plasma) campione: rilevare direttamente il campione.

II. Determinazione procedura:

1. Preriscaldare lo spettrofotometro per 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 560 nm e azzerare con acqua distillata.
2. Conservare il reagente Ⅰ, Reagente Ⅲ, Reagente V a bagnomaria per più di 5 minuti a 37℃(mammifero) O

25℃ (altre specie).

3. Aggiungere i reagenti con il seguente elenco:

Reagente (μL)	Provetta (T)	Tubo di controllo (C)	Tubo vuoto (B1)	Tubo vuoto (B2)
Campione	90	90	–	–
Reagente ⅰ	240	240	240	240
Reagente Ⅱ	6	–	6	–
Reagente Ⅲ	180	180	180	180
Acqua distillata	480	486	570	576
Reagente V	30	30	30	30

Mescolare accuratamente e la miscela viene incubata a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere la miscela in una cuvetta di vetro da 1 ml, e rilevare il valore di assorbanza di ciascun tubo a 560 nm. ΔAT=AT-AC，ΔAB=AB1-AB2. Se c'è precipitazione sul fondo, mescolare accuratamente e quindi misurare.

III. Calcolo:

1. Percentuale di inibizione:

Percentuale di inibizione=[ΔAB-ΔAT]÷ΔAB× 100%

La percentuale di inibizione dovrebbe essere compresa tra il 30% e il 70% (il valore vicino a 50% avrà un risultato più accurato). Se la percentuale di inibizione calcolata è inferiore a 30% o più di 70%, di solito è necessario regolare la quantità di aggiunta del campione e determinarla nuovamente. Se la percentuale di inibizione è troppo alta, il campione deve essere diluito adeguatamente. Se la percentuale di inibizione è troppo bassa, il campione deve essere preparato nuovamente con una concentrazione più elevata.

2. Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'inibizione di 50% nel sistema di reazione della xantina di cui sopra
3. Calcolo

UN. Siero (plasma)campione

ZOLLA ERBOSA (U/ml)=[P÷(1-P)×Vrv]÷Vs×F=11,4×P÷(1-P)×F

B. Tessuto, batteri o cellule in coltura

UN) Concentrazione proteica:

ZOLLA ERBOSA (U/ml prot) = [P÷(1-P)×Vrv]÷(Vs×Cpr)×F=11,4×P÷(1-P)÷Cpr×F

B) Peso del campione

ZOLLA ERBOSA (Peso U/g) = [P÷(1-P)×Vrv]÷(W×Vs÷Vsv)×F=11,4×P÷(1-P)÷L×P

C) Quantità di batteri o cellule

ZOLLA ERBOSA (Cella U/104)=[P÷(1-P)×Vrv]÷(500×Vs÷Vsv)×F=0,0228×P÷(1-P)×F

Corda: Volume totale di reazione, 1.026 ml; Contro: Volume del campione, 0.09 ml;

Vsv: Volume di estrazione, 1 ml;

Cpr: Concentrazione proteica del campione, mg/ml; W: Peso del campione, G;

500: Numero totale di batteri e cellule, 5 milioni. P: Percentuale di inibizione, %;

F: Diluizione multipla del campione.

Nota:

1. Il campione e il reagente Ⅱ devono essere posizionati sul ghiaccio quando
2. Quando ci sono molti campioni, la soluzione di lavoro (compreso il reagente I, II e III) può essere configurato secondo la tabella. È necessario aggiungere il reagente V
3. Dopo che la reazione è stata completata, potrebbero formarsi delle precipitazioni, che potrà essere determinato successivamente

Esempi sperimentali:

1. 1 vengono aggiunti g di Echinochloa crusgalli 1 mL di reagente di estrazione per omogeneizzazione. Dopo aver prelevato il surnatante, l'operazione viene effettuata secondo gli step di determinazione. I risultati hanno mostrato che ΔAT = AT – CA = 0.335-0.012 = 0.323, ΔAB = AB1 – AB2 = 0.957-0.003 = 0.954. Percentuale di inibizione = (ΔAB- ΔAT)÷ δab × 100% = 72%, e l'attività enzimatica viene calcolata in base alla massa del campione.

Attività SOD (Massa U/g) = 11.4 × Percentuale di inibizione (1-Percentuale di inibizione) × L = 293.14 Massa U/g.

2. 1 Vengono aggiunti mL di reagente di estrazione 0.1 g di milza di ratto per omogeneizzazione. Dopo aver prelevato il surnatante, l'operazione viene effettuata secondo gli step di determinazione. I risultati hanno mostrato che ΔAT= AT- CA = 0.563-0.213 = 0.35, ΔAB=AB1- AB2= 0.957-0.003 = 0.954, percentuale di inibizione = (ΔAB-ΔAT)÷ ΔAB×100% =31%

Attività SOD (Massa U/g) = 11.4 × Percentuale di inibizione (1-Percentuale di inibizione) ×L = 196.71 Massa U/g.

3. 10 milioni di cellule vengono estratte e centrifugate aggiungendo 1 mL di reagente di estrazione, e quindi l'operazione viene eseguita secondo le fasi di determinazione. I risultati sono i seguenti: ΔAT =AT – AC=614-0,015 = 0.599, ΔAB=AB1- AB2= 0.944-0.005 = 0.939, percentuale di inibizione = (ΔAB- ΔAT) ×ΔAB× 100% = 36.21%

Attività SOD (Cella U/104) = Percentuale di inibizione ÷ (1-Percentuale di inibizione)×VTS]÷(1000× VS ÷ VTS) = 0.0065 Cella U/104.

Riferimenti:

• Spitz D.R, Oberley LW. Un test per l'attività della superossido dismutasi negli omogenati di tessuti di mammiferi[J]. Biochimica analitica, 1989,179(1):8-18.
• Masayasu M, Hiroshi Y. Un metodo di analisi semplificato dell'attività della superossido dismutasi per uso clinico[J]. Clinica Chimica Acta, 1979,92(3):337-342.

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