Solarbio lattato deidrogenasi (LDH) Kit di analisi dell'attività

Lattato deidrogenasi (LDH) Kit di analisi dell'attività

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.

Attrezzatura operativa: Lettore spettrofotometro/micropiastre

Gatto n: BC0685

Misurare:100T/48S

Componenti:

Estrarre la soluzione: 60 ml×1. Conservazione a 4 ℃；

Reagente I: 7 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente II: polvere × 1. Conservazione a -20 ℃. Soluzione funzionante: dissolversi con 1.3 ml di acqua distillata prima dell'uso. Può essere diviso in tubulo dopo l'abbinamento, che può essere conservato per due settimane a -20℃. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento.

Reagente III: 7 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente IV: 25 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Soluzione standard di piruvato di sodio: 1 ml (2 µmol/ml) ×1. Conservazione a 4 ℃.

Descrizione del prodotto:

Lattato deidrogenasi (LDH o LD) è l'enzima terminale della via della glicolisi che si trova in quasi tutte le cellule viventi (animali, impianti, e procarioti). LDH catalizza la conversione del lattato in acido piruvico e viceversa, poiché converte NAD+ in NADH e viceversa.

Il NAD+ e l'acido lattico vengono ossidati ad acido piruvico mediante catalisi dell'LDH. Il piruvato ha reagito ulteriormente con 2,4-dinitrofenilidrazide per formare piruvato dinitrobenzone, che mostrano un colore rosso bruno in soluzione alcalina e la profondità del colore è proporzionale alla concentrazione di piruvato.

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti:

Spettrofotometro/lettore di micropiastre, bagnomaria con termostato, centrifuga da tavolo, pipetta regolabile, microcuvetta in vetro/piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, mortaio/omogeneizzatore, ghiaccio, acqua distillata.

Procedura:

IO. Campione preparazione:

1. Batteri, cellule, o campione di tessuto:

Batteri o cellule:

Raccolta di batteri o cellule nella provetta da centrifuga. Il liquido nello strato superiore viene scartato dopo la centrifugazione. Il rapporto tra quantità di batteri/cellule (104): Estrarre il volume della soluzione (ml) è 500 ~ 1000:1(Si suggerisce di prendere 5 milioni di batteri/cellula e aggiungere 1 ml di soluzione di estratto). I batteri e le cellule vengono divisi mediante ultrasuoni (posto sul ghiaccio, 200W, tempo di lavoro 3 secondi, intervallo 10s, ripetere per 30 volte). Centrifugare a 8000 giri al minuto 4℃ per 10 minuti, prendi il surnatante e mettilo nel ghiaccio per il test.

Tessuto:

L'omogeneità del bagno di ghiaccio è condotta in base al rapporto della massa tissutale (G): Estrarre il volume della soluzione (ml) = 1: 5~10 (si consiglia di prendere circa 0.1 g di tessuto e aggiungere 1 ml di soluzione di estratto). Omogeneizzazione con bagno di ghiaccio. Centrifugare a 8000 giri al minuto e 4 ℃ per 10 minuti, prendi il surnatante e mettilo nel ghiaccio per il test.

2. Siero (plasma)campione:

Rileva direttamente il campione.

II. Procedura:

1. Preriscaldare lo spettrofotometro/lettore di micropiastre 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 450 nm, azzerare con acqua distillata.
2. Soluzione standard di piruvato di sodio: Prendere 100 μL di soluzione standard, diluire a 1, 5, 0.25, 0.125, 0 µmol/ml, e utilizzare 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0 μmol/mL come curva standard.

3. Prova del campione

Nome del reagente (μL)	Provetta(A)	Tubo di controllo(Ac)	Tubo standard(COME)
Campione	10	10	–
Soluzione standard	–	–	10
Reagente I	50	50	50
Reagente II	10	–	–
Acqua distillata	–	10	10
Mescolato accuratamente, incubare a 37 ℃(mammifero) o 25 ℃(altre specie) bagnomaria per 15 minuti.
Reagente III	50	50	50
Mescolato accuratamente, incubare a 37 ℃(mammifero) o 25 ℃(altre specie) bagnomaria per 15 minuti.
Reagente IV	150	150	150

Mescolato accuratamente, posto a temperatura ambiente per 3 minuti. Prendere 200 μL di soluzione di reazione in microcuvetta di vetro/piastra a fondo piatto da 96 pozzetti, misurato l'assorbanza a 450 nm, ΔA=AT-AC. Ogni provetta dovrebbe contenere una provetta di controllo.

III. LDH Calcoli.

1. Esempio del contenuto di piruvato di sodio
2. Imposta la curva standard, asse y come concentrazione standard, µmol/ml, asse x come 450 assorbimento in nm. Metti ΔA(X) nella curva standard, calcola y(µmol/ml)
3. Siero (plasma) campione di attività LDH

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che ne catalizza la produzione 1 nmol di acido piruvico al minuto, ogni millilitro di siero.

LDH(U/ml)=y÷T×103=66,7×y

4. Tessuto, attività LDH di batteri o cellule in coltura

UN. Concentrazione proteica:

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che ne catalizza la produzione 1 nmol di acido piruvico al minuto, ogni milligrammo di proteine.

LDH(U/mg prot)= y÷T÷Cpr×103 =66,7×y÷Cpr

B. Peso del campione

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che ne catalizza la produzione 1 nmol di acido piruvico al minuto, in ogni grammo di tessuto. LDH(U/g)= y÷T÷W×103 =666,7×y

C. Quantità di celle

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che ne catalizza la produzione 1 nmol di acido piruvico al minuto ogni 10000 cellule.

LDH(U/104 cella)= y÷T÷500×103 =0,133×y

Contro: Volume supernato (ml), 0.01 ml; Vsv: Estrarre il volume della soluzione, 1 ml; T: Tempo di reazione, 15 minuti;

Cpr: Concentrazione proteica del campione, mg/ml; W: Peso del campione, 0.1 G;

500: Numero totale di batteri o cellule, 5 milioni; 103: 1 µmol/ml=103 nmol/ml.

Riferimenti

[1] Huang P H, F, Huang C S, et al. L'assorbimento dell'oligogalatturonide e il suo effetto sull'inibizione della crescita, attività della lattato deidrogenasi e rilascio di galattina-3 da parte delle cellule tumorali umane[J]. Chimica degli alimenti, 2012, 132(4): 1987-1995.

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