Lipasi epatica (HL) Kit di analisi dell'attività

Nota: Prendi due o tre campioni diversi per la previsione prima del test.

Attrezzatura operativa: Spettrofotometro

Gatto n: BC2380

Misurare:50T/24S

Componenti:

Reagente I: 100 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente II: 3 ml×1. Conservazione a 4 ℃.

Reagente III: Polvere×1. Conservazione a 4 ℃. Prima dell'uso, aggiungere 30 mL di acqua distillata, dissolversi completamente.

Reagente IV: Polvere×2. Conservazione a -20 ℃. Prima dell'uso, aggiungere 2 ml di acqua distillata a quella, dissolversi completamente. Il reagente disciolto può essere immagazzinato -20 ° C dopo il reimballaggio. Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento;

Standard: Polvere×1. Prima dell'uso, 6.94 ml di acetone viene aggiunto per preparare un file 10 μmol/ml α-naftolo

soluzione standard, che è stato completamente sciolto prima dell'uso.

Descrizione del prodotto:

Lipasi epatica (HL) è un enzima lipolitico sintetizzato nelle cellule parenchimali epatiche. È presente sulla superficie delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche e sulla superficie dei microvilli di epatociti nello spazio sinusoidale, e può idrolizzare varie lipoproteine. I trigliceridi (T.G) e fosfolipidi (Pl) Nel mezzo cambiano la dimensione e la densità di varie particelle di lipoproteine. Quando l'HL e la sua attività nel plasma aumentano, Può portare a lipoproteine ​​a bassa densità (Ldl) livelli nel plasma, Aumentare e accelerare il verificarsi e lo sviluppo dell'aterosclerosi.

Hl Idricolizzano α-naftil acetato per produrre α-naftolo, che può formare un composto Azo rosso viola con sale blu b blu veloce. Ha un picco di assorbimento caratteristico a 595 nm, e la sua profondità del colore è positivamente correlata con l'attività dell'esterasi epatica in un certo intervallo.

Reagenti e attrezzature necessari ma non forniti:

Spettrofotometro, bagnomaria, bilancia, centrifuga, trasferimento regolabile, 1 Cuvetta di vetro da ml, mortaio/omogeneizzatore, Crusher ad ultrasuoni, ghiaccio e acqua distillata.

Procedura:

IO. Enzima estrazione

1. Tessuto

Secondo la massa tissutale (G): il volume del reagente i (ml) È 1:5~ 10 per estrarre. Si consiglia di aggiungere 1 ml di reagente i a 0.1 g di tessuto, e completamente omogeneizzare sul bagno di ghiaccio. Centrifuga a 10000 g per 10 minuti a 4℃ per rimuovere materiali insolubili, e portare il surnatante sul ghiaccio prima del test.

2. Batteri o cellule

Secondo i batteri o le cellule (104): il volume del reagente i (ml) è 500 ~ 1000:1. Si consiglia di aggiungere 1 ml di reagente i a 5 milioni di batteri o cellule. Usa l'ecografia per dividere i batteri e le cellule (posto sul ghiaccio, Potenza ad ultrasuoni 300W, Tempo di lavoro 3s, intervallo 7s, tempo totale 3 min). Centrifugare a, 10000g per 10 minuti a 4 ℃ per rimuovere i materiali insolubili e prendere il surnatante sul ghiaccio prima di testare.

3. Terreno di coltura o altro liquido: Rileva direttamente.

II. Rilevamento

• Preriscaldare lo spettrofotometro per 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 595 nm, azzerare con acqua distillata.
• Preriscaldare il reagente III a 30 ℃ per più di 20 minuti.
• Standard: Diluire la soluzione standard da 10μmol/ml a 1.25, 0.625, 0.3125, 0.15625, 0.078μmol/ml con reagente i.
• Aggiungere i seguenti reagenti 1.5 ML EP Tubi:

	Tubo di contrasto (C)	Provetta (T)	Tubo standard (S)	Tubo vuoto (B)
Campione (μL)	100	100	–	–
Soluzione standard (μL)	–	–	100	–
Reagente I (μL)	450	400	400	500
Reagente II (μL)	–	50	50	50
Mescolare e reagire per 10 Il mio a 30 ℃			–	–
Reagente III (μL)	400	400	400	400
Reagente IV (μL)	50	50	50	50
Mescolare accuratamente e rilevare l'assorbanza a 595 nm, Record come AC, A, AS e AB rispettivamente. ΔAT =(AT-AC), ΔAS =(As-ab). È necessario un tubo di contrasto per ciascun tubo di prova, e la curva standard deve essere testata solo una o due volte.

III. Calcolo:

1.Curva standard

La concentrazione di soluzione standard come asse x, ΔAS come asse y, Ottieni l'equazione y = kx+b. Prendi ΔAT all'equazione per acquisire x (µmol/ml) valore.

2. Calcolo

• Concentrazione proteica tissutale

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'idrolisi di α-naftil acetato per generare 1 μmol di α-naftolo ogni mg di proteina nel sistema di reazione al minuto a 40 ℃.

Attività HL (U/mg prot)= x × vs ÷ （vs × cpr） ÷ t = 0,1x ÷ cpr

• Peso del tessuto

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come l'enzima di quantità che catalizza l'idrolisi di α-naftil acetato per generare 1 μmol di α-naftolo ogni grammo di tessuto nel sistema di reazione al minuto a 40 ℃.

Attività HL (Peso U/g) = x × vs ÷(W × vs ÷ ve)÷ t = 0,0333x ÷ w

• Liquido

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'idrolisi di α-naftil acetato per generare 1 μmol di α-naftolo ogni millilitro del campione liquido nel sistema di reazione al minuto a 40 ℃.

Attività HL (U/ml) = x × vs ÷ vs ÷ t = 0,1x

• Batteri o cellule coltivate

Definizione di unità: Un'unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima che catalizza l'idrolisi di α-naftil acetato per generare 1 μmol di α-Naphthol ogni 104 cellule o batteri nel sistema di reazione al minuto a 40 ℃.

Attività HL (U/104 cella) = x × ve ÷ cella quantità ÷ t = 0,1x ÷ quantità di cella

Contro: Volume del campione (ml), 0.1 ml; Ve: Estrarre il volume della soluzione, 1 ml;

Cpr: Concentrazione di proteina del campione di surnatante (mg/ml); T: Tempo di reazione (min), 10 minuti;

W: Peso del campione, G;

Quantità di celle: 10 Mille come unità.

Nota:

1. Se il campione è fegato animale, Si consiglia di diluire il campione con reagente I più di 25 volte prima del test, e moltiplicare il fattore di diluizione nel calcolo
2. Se il campione è siero o plasma da animali obesi, Si consiglia di diluire il campione con reagente I più di 5 volte prima del test, e moltiplicare il fattore di diluizione nel calcolo
3. Quando ΔA è maggiore di 0.8, Si consiglia di misurare il campione dopo averlo diluito con il reagente, e moltiplicarlo per il fattore di diluizione nel calcolo

Esempio sperimentale:

1. 1Il fegato di ratto G è stato preso per l'elaborazione del campione, e il surnatante è diluito 24 volte, quindi l'operazione viene eseguita secondo le fasi dell'operazione. Misurato e calcolato da 96 bene piatto: ΔA = AT-AB = 0,713-0,001 = 0,712, e la curva standard: y = 0,6381x – 0.0005, Calcola x = 1.1166

Attività HL (Massa U/g) = x × vs ÷ (W × vs ÷ vst)÷ t × 48 = 53.597 Massa U/g.

2. Dopo che il siero di tacchino è stato diluito 6 volte, L'operazione è stata eseguita in base alle fasi dell'operazione. Misurato e calcolato da 96 bene piatto: ΔA = AT-AB = 0,572-0,003 = 0,569, e la curva standard: y = 0,6381x – 0.0005, Calcola x = 892

Attività HL (Massa U/g) = x × vs ÷ (W × vs ÷ vst)÷ t × 12 = 1.071 Massa U/g

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