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Introduzione al prodotto：
This reagent kit can amplify and detect the CHD-W conserved gene in samples such as feathers, sangue, and tissues of parrots, thereby determining their gender. Introducendo un riferimento interno endogeno, the nucleic acid extraction and amplification processes can be monitored to ensure the accuracy of the test results.
Contenuto del prodotto：
| Componenti del reagente | AN2304001-01（24T） | AN2304001-02（48T） |
| CW reaction solution | 23µL/Well × 8wells/Strip × 3Strips | 23µL/Well × 8wells/Strip × 6stips |
| CW Positive control | 100μL | 100μL |
| Controllo negativo | 100μL | 100μL |
Condizioni di stoccaggio：
Conservare a -20 ℃, La durata della conservazione è almeno 12 mesi
Operazione sperimentale：
1. preparazione del campione (Area di preparazione del campione)
1.1 Requisiti del campione：
Piume: Collect at least 5 piume dal petto, addome, o gambe (compresa la porzione di piuma), e non usare le piume per capannoni naturali.
Sangue: Usa EDTA come anticoagulante, Non usare l'eparina come anticoagulante. Dovrebbe essere usato il sangue intero fresco, oppure può essere conservato a 2 ~ 8 ℃ fino a 7 giorni, o conservato a -20 ℃ fino a 3 mesi. Evitare il più possibile congelamento e scongelamento.
Tessuto: Prendi muscoli freschi o tessuto di organi (Evita di usare campioni con pelle, tendini, o fascia difficile da elaborare) di non più di 100 mg. Preparare omogenato di tessuto usando 200-500 μl di acqua sterile, e quindi procedere con la successiva preparazione del campione.
1.2 preparazione del campione：
Please refer to the Three Lions Biotech “Kit di estrazione rapida del DNA genomico animale (per PCR analisi)” manuale (Numero parte: DP202), o altri kit/metodi di estrazione dell'acido nucleico che soddisfano i requisiti rilevanti, to extract the processed samples. Posizionare l'acido nucleico del campione estratto in una ghiacciaia e provare a procedere prontamente ai test. Può essere conservato a 4 ° C fino a fino a 7 giorni o a -20 ° C fino a fino a 6 mesi.
2 . Preparazione del sistema di reazione (Area di reazione per l'aggiunta di campioni).
2.1 Take out n+2 reaction tubes containing CW positive control, CW negative control, e la soluzione di reazione necessaria per l'esperimento (n rappresenta il numero di campioni da testare, più 1 controllo positivo, E 1 controllo negativo). Scongelare i reagenti completamente a temperatura ambiente, centrifuga per 10 secondi, e girare il liquido all'interno delle pareti del tubo e dei tappi sul fondo del tubo. Mettili in una ghiacciaia per un uso successivo.
2.2 Poi, Aggiungi 2μl di controllo negativo, acido nucleico del campione estratto, and CW positive control to the reaction solution in sequence. Chiudi i tappi del tubo, fare record adeguati, e assicurarsi che il volume totale di ciascuna reazione sia 25 μl. Mescolare accuratamente il contenuto, centrifuga per 10 secondi, e quindi procedere con l'esperimento di amplificazione sullo strumento PCR.
3. Amplificazione PCR (Area di amplificazione e analisi del prodotto).
Pre-denaturazione a 95 ° C per 3 minuti; Denaturazione a 95 ° C per 10 secondi, Annealing and extension at 58°C for 30 secondi, per 35 cicli, collecting fluorescence signal at 58°C. The fluorescence channel 1 should be set to FAM (CHD-W gene), and channel 2 should be set to VIC/HEX (endogenous reference gene) (when using the ABI series real-time fluorescence quantitative PCR instrument, se necessario, contact the manufacturer in advance or add ROX calibration dye by yourself; Altrimenti, Seguire la normale procedura).
4. Determinazione dei risultati
4.1 Se i valori CT del controllo positivo sia nel canale FAM e nel canale VIC/HEX <28 e mostra un “S”-curva di amplificazione a forma di sagoma, e il controllo negativo non ha valore CT o un valore CT ≥35 e no “S”-curva di amplificazione a forma di sagoma, Il risultato sperimentale è valido. Altrimenti, L'esperimento dovrebbe essere ripetuto, E se l'esperimento ripetuto è ancora non valido, Si prega di contattare il personale tecnico del produttore.
4.2 The Ct value of the sample in the VIC/HEX channel should be ≤30 and show an “S”-curva di amplificazione a forma di sagoma, indicando che l'estrazione e l'amplificazione del campione sono efficaci. Se non esiste un valore CT o il valore CT è 30 < CT ≤ 35 nel canale Vic/Hex, Indica che l'estrazione dell'acido nucleico del campione non è all'altezza o c'è una forte interferenza di inibizione (come residui di alcol o disinfettanti, anticoagulanti, eccetera.) Ciò inibisce l'amplificazione. Si consiglia di ritrattare il campione per l'estrazione e l'amplificazione dell'acido nucleico.
4.3 Dopo il rilevamento nel canale Vic/Hex è valido, La determinazione nel canale FAM viene eseguita come segue:
- Valore CT ≤ 30 e un “S”-Si osserva una curva di amplificazione sagomata, and the Ct difference between the two channels is less than 5, it is determined as positive for the CHD-W gene, indicating that the sample is from a female.
- Valore CT ≤ 30 e un “S”-Si osserva una curva di amplificazione sagomata, but the Ct difference between the two channels is ≥ 5, or Ct value is 30 < Ct < 32, all are considered as suspicious, e si raccomanda un test (Si suggerisce di escludere prima “falso positivo” Risultati causati dalla contaminazione dell'aerosol ambientale, and then proceed with nucleic acid extraction and testing). Se il test nel canale FAM dopo aver escluso la contaminazione dell'aerosol mostra un valore CT < 30 e una chiara curva di amplificazione, and the Ct difference between the two channels is less than 5, it is determined as positive for the CHD-W gene; Altrimenti, è determinato come negativo.
- Nessun valore CT o valore CT ≥ 32 e no “S”-curva di amplificazione a forma di sagoma, it is determined as negative for the CHD-W gene, indicating that the sample may come from a male.
Precauzioni：
1）To prevent contamination, L'esperimento dovrebbe essere condotto rigorosamente con operazioni partizionate. È preferibile avere l'isolamento fisico tra le partizioni per evitare la contaminazione incrociata causata da fattori umani. Indossare cappotti da laboratorio e guanti in lattice durante l'esperimento, e utilizzare strumenti separati in diverse aree. Cambia guanti e cappotti da laboratorio secondo necessità. Dopo la PCR, Non aprire immediatamente i coperchi. Attendere il raffreddamento sufficiente prima di aprire per il campionamento per ridurre al minimo la contaminazione dell'aerosol.
2）Thaw the reagents completely before use, ma evita di congelare e scongelare ripetuti. Seguire le istruzioni rigorosamente per la preparazione del reagente, Aggiunta del campione, e altri passaggi. Il banco di lavoro, centrifuga, Pipette, e altri strumenti dovrebbero essere regolarmente disinfettati usando disinfettanti contenenti cloro, etanolo, Agenti di rimozione della contaminazione dell'acido nucleico, o lampade ultraviolette.
3）A negative result does not necessarily mean a male. Mutazioni sconosciute, scarsa qualità del campione, bassa concentrazione, o la presenza di forti sostanze inibitorie nell'estrazione dell'acido nucleico (Test) può anche portare a “negativo” risultati. Questo kit viene utilizzato solo per l'amplificazione specifica del gene CHD-W nei pappagalli. Per altri prodotti, Si prega di consultare il produttore.
4）This product is for single use only. Non congelare ripetutamente e scongelare. È solo a scopo di ricerca scientifica e non dovrebbe essere utilizzato per la diagnosi clinica o altri scopi.
