Panoramica del Prodotto
NR (CE 1.7.1.3) è un enzima ampiamente trovato nelle piante. Ha un ruolo cruciale nella conversione dell'azoto di nitrato in azoto di ammoniaca ed è anche un enzima inducibile, influire sulla resa e sulla qualità delle colture. NR catalizza la riduzione del nitrato in nitrito: NO3- + NADH+ H+ → NO2- + Loro+ + H2O. In condizioni acide, il NO2 prodotto- può partecipare a una reazione di diazotizzazione per formare un composto color magenta. Questo composto ha un picco di assorbimento a 540 nm, e il cambiamento di assorbanza a 540 NM può essere usato per rappresentare l'attività enzimatica.
Componenti del kit
- Soluzione madre dell'induttore: 50 ml x 1 bottiglia
- Soluzione di estrazione: 30 ml x 1 bottiglia
- Reagente uno: 12 ml x 1 bottiglia
- Reagente due: Polvere x 2 fiale
- Reagente tre: 15 ml x 1 bottiglia
- Reagente quattro: 15 ml x 1 bottiglia
- Standard: 1 ml x 1 Fial
Preparazione della soluzione
- Soluzione induttore: Diluire la soluzione madre dell'induttore 10 volte con acqua distillata prima dell'uso. Prendere 10 ml di soluzione madre dell'induttore e aggiungere 90 mL di acqua distillata. Mescolare accuratamente. Preparare fresco prima di ogni utilizzo.
- Reagente due: Aggiungere 1 mL di acqua distillata. Aliquota e conservare a -20 ° C. Può essere conservato per 2 settimane a -20 ° C.. Prima dell'uso, Reagente diluito due 50 volte con acqua distillata. Prendere 10 μl di reagente due e aggiungi 490 µl di acqua distillata. Mescolare bene.
- Standard: Preparare un 0.1 μmol/ml Soluzione standard di nitrito di sodio diluindo il 10 μmol/ml Soluzione standard di nitrito di sodio 100 volte con acqua distillata prima dell'uso.
Appunti
- Se l'assorbanza è maggiore di 0.8, diluire il campione con soluzione di estrazione. Prestare attenzione all'adeguamento del fattore di diluizione di conseguenza nella formula di calcolo.
- Segui rigorosamente l'ordine di aggiungere reagenti elencati nella tabella del test del campione per l'esperimento.
Procedure sperimentali
IO. Trattamento campione
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Pretrattamento del tessuto:
- Aggiungi una quantità adeguata di soluzione induttore a un becher. Lavare campioni freschi, asciugali con carta da filtro, e posizionarli nella soluzione induttore (abbastanza per immergersi). Incubare al buio per 2 ore. Rimuovere i campioni, asciugali con carta da filtro, e congelare a -20 ° C per 30 minuti. Scongelare i campioni e asciugarli di nuovo con carta da filtro. (Eseguire il trattamento a induzione secondo necessità. Generalmente, Non è richiesto il trattamento a induzione. Se i risultati pre-esperimento non mostrano attività, È necessario il trattamento di induzione.)
- Pesare approssimativamente 0.1 g di campione e aggiungi 1 ml di soluzione di estrazione in base al rapporto del peso dei tessuti (G) al volume della soluzione di estrazione (ml) Di 1:5 A 10. Macinare in un bagno di ghiaccio, centrifugare a 8000 G, 4°C per 10 minuti, e raccogli il surnatante. Mantieni il surnatante sul ghiaccio per il test.
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Pretrattamento cellulare o batterio:
- Raccogli campioni di cellule o batteri in un tubo di centrifuga e scartare il surnatante. Aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione per 5 milioni di cellule o batteri. Sonicate i batteri o le cellule (energia 200 W, sonicazione 3 secondi, intervallo 10 secondi, ripetere 30 volte). Centrifugare a 8000 G, 4°C per 10 minuti, raccogliere il surnatante e conservarlo in ghiaccio per i test.
II. Passaggi del dosaggio
- Preriscalda almeno lo spettrofotometro visibile 30 minuti, regolare la lunghezza d'onda su 540 nm, e zero con acqua distillata.
- Assaggi di esempio:
| Nome del reagente | Provetta | Tubo di controllo | Tubo standard | Tubo vuoto |
|---|---|---|---|---|
| Campione | 100 μL | – | – | – |
| 0.1 soluzione standard μmol/ml | – | – | 100 μL | – |
| Acqua distillata | – | 375 μL | – | 475 μL |
| Reagente uno | 375 μL | – | 375 μL | – |
| Reagente due | 125 μL | 125 μL | 125 μL | 125 μL |
| Reagente tre | 250 μL | 250 μL | 250 |
Recensioni
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