Kit per test dell'acido nucleico del poliomavirus aviario丨Metodo molecolare

Questo prodotto deve essere imballato con sacche di ghiaccio e spedito tramite FedEx o UPS.

Introduzione al prodotto：

Questo kit di reagenti può eseguire il rilevamento dell'amplificazione dei geni conservati del virus del polioma aviario (APV) in campioni come uccello piume, sangue, tessuti, tamponi orali/genitali, eccetera. Introducendo un riferimento interno endogeno, Il processo di estrazione e amplificazione dell'acido nucleico può essere monitorato per garantire l'accuratezza dei risultati del test.

Contenuto del prodotto：

Componenti del reagente	AP2304001-01 （24T）	AP2304001-02 （48T）
Soluzione di reazione APV	23µL/Well × 8wells/Strip × 3Strips	23µL/Well × 8wells/Strip × 6stips
Controllo positivo APV	100μL	100μL
Controllo negativo	100μL	100μL

Condizioni di stoccaggio：

Conservare a -20 ℃, La durata della conservazione è almeno 12 mesi

Operazione sperimentale：

1. preparazione del campione (Area di preparazione del campione)

1.1 Requisiti del campione：

• Piume: Raccogliere 5 piume dal petto, addome, o gambe (compresa la porzione di piuma), e non usare le piume per capannoni naturali.
• Sangue: Usa EDTA come anticoagulante, Non usare l'eparina come anticoagulante. Dovrebbe essere usato il sangue intero fresco, oppure può essere conservato a 2 ~ 8 ℃ fino a 7 giorni, o conservato a -20 ℃ fino a 3 mesi. Evitare il più possibile congelamento e scongelamento.
• Tessuto: Prendi muscoli freschi o tessuto di organi (Evita di usare campioni con pelle, tendini, o fascia difficile da elaborare) di non più di 100 mg. Preparare omogenato di tessuto usando 200-500 μl di acqua sterile, e quindi procedere con la successiva preparazione del campione.

1.2 preparazione del campione：

• Fare riferimento al manuale della biotecnologia dei tre leoni “Kit di estrazione rapida del DNA genomico animale (per PCR analisi)” (Numero parte: DP202), o altri kit/metodi di estrazione dell'acido nucleico che soddisfano i requisiti rilevanti, Per l'estrazione di campioni elaborati.
• Posizionare l'acido nucleico del campione estratto in una ghiacciaia e provare a procedere prontamente ai test.
• Può essere conservato a 4 ° C fino a fino a 7 giorni o a -20 ° C fino a fino a 6 mesi.

2 . Preparazione del sistema di reazione (Area di reazione per l'aggiunta di campioni).

2.1 Eliminare i tubi di reazione N+2 contenenti controlli positivi APV, Controllo negativo APV, e la soluzione di reazione necessaria per l'esperimento (n rappresenta il numero di campioni da testare, più 1 controllo positivo, E 1 controllo negativo). Scongelare i reagenti completamente a temperatura ambiente, centrifuga per 10 secondi, e girare il liquido all'interno delle pareti del tubo e dei tappi sul fondo del tubo. Mettili in una ghiacciaia per un uso successivo.

2.2 Poi, Aggiungi 2μl di controllo negativo, acido nucleico del campione estratto, e controllo positivo di APV alla soluzione di reazione in sequenza. Chiudi i tappi del tubo, fare record adeguati, e assicurarsi che il volume totale di ciascuna reazione sia 25 μl. Mescolare accuratamente il contenuto, centrifuga per 10 secondi, e quindi procedere con l'esperimento di amplificazione sullo strumento PCR.

3. Amplificazione PCR (Area di amplificazione e analisi del prodotto).

• Il processo di amplificazione PCR è il seguente:
  • Pre-denaturazione a 95 ℃ per 3 minuti.
  • Denaturazione a 95 ℃ per 10 secondi.
  • Ricottura ed estensione a 60 ℃ per 40 secondi, per un totale di 35 cicli.
  • Raccogli segnali di fluorescenza a 60 ℃.
• Nel rilevamento della fluorescenza, Seleziona Fam per il primo canale (per APV specifico del gene), e seleziona Vic/Hex per il secondo canale (per il gene di riferimento endogeno).
• Se si utilizza uno strumento PCR quantitativo di fluorescenza in tempo reale della serie ABI, È possibile contattare il produttore in anticipo o aggiungere da solo la tintura di calibrazione ROX; Altrimenti, Seguire la normale procedura.

4. Determinazione dei risultati

4.1

• Se i valori CT del controllo positivo sia nel canale FAM e nel canale VIC/HEX <30 e mostra un “S”-curva di amplificazione a forma di sagoma, e il controllo negativo non ha valore CT o un valore CT ≥35 e no “S”-curva di amplificazione a forma di sagoma, Il risultato sperimentale è valido.
• Altrimenti, L'esperimento dovrebbe essere ripetuto, E se l'esperimento ripetuto è ancora non valido, Si prega di contattare il personale tecnico.

4.2

• Il valore CT del campione nel canale Vic/Hex dovrebbe essere ≤32 e mostrare un “S”-curva di amplificazione a forma di sagoma, indicando che l'estrazione e l'amplificazione del campione sono efficaci.
• Se non esiste un valore CT o il valore CT è 32 < CT ≤ 35 nel canale Vic/Hex, Indica che l'estrazione dell'acido nucleico del campione non è all'altezza o c'è una forte interferenza di inibizione (come residui di alcol o disinfettanti, anticoagulanti, eccetera.) Ciò inibisce l'amplificazione.
• Si consiglia di ritrattare il campione per l'estrazione e l'amplificazione dell'acido nucleico.

4.3 Dopo il rilevamento nel canale Vic/Hex è valido, La determinazione nel canale FAM viene eseguita come segue:

• Valore CT ≤ 32 e un “S”-Si osserva una curva di amplificazione sagomata, è determinato come positivo per APV, indicando la presenza di virus APV nel campione.
• Il valore CT è 32 < Ct < 35, è considerato sospetto, e il campione dovrebbe essere ritestato (Riestrando e testando l'acido nucleico, Si suggerisce di escludere prima “falso positivo” Risultati causati dalla contaminazione dell'aerosol ambientale). Se il test nel canale FAM dopo aver escluso la contaminazione dell'aerosol mostra un valore CT < 35 e una chiara curva di amplificazione, è determinato come positivo per APV; Altrimenti, è determinato come negativo.
• Nessun valore CT o valore CT ≥ 35 e no “S”-curva di amplificazione a forma di sagoma, è determinato come negativo per APV, indicando che il virus APV non è stato rilevato nel campione.

Precauzioni：

1. Per prevenire la contaminazione, L'esperimento dovrebbe essere condotto rigorosamente con operazioni partizionate. È preferibile avere l'isolamento fisico tra le partizioni per evitare la contaminazione incrociata causata da fattori umani. Indossare cappotti da laboratorio e guanti in lattice durante l'esperimento, e utilizzare strumenti separati in diverse aree. Cambia guanti e cappotti da laboratorio secondo necessità. Dopo la PCR, Non aprire immediatamente i coperchi. Attendere il raffreddamento sufficiente prima di aprire per il campionamento per ridurre al minimo la contaminazione dell'aerosol.
2. Scongelare i reagenti completamente prima dell'uso, ma evita di congelare e scongelare ripetuti. Seguire le istruzioni rigorosamente per la preparazione del reagente, Aggiunta del campione, e altri passaggi. Il banco di lavoro, centrifuga, Pipette, e altri strumenti dovrebbero essere regolarmente disinfettati usando disinfettanti contenenti cloro, etanolo, Agenti di rimozione della contaminazione dell'acido nucleico, o lampade ultraviolette.
3. Un risultato negativo non significa necessariamente un maschio. Mutazioni sconosciute, scarsa qualità del campione, bassa concentrazione, o la presenza di forti sostanze inibitorie nell'estrazione dell'acido nucleico (Test) può anche portare a “negativo” risultati. Questo kit viene utilizzato solo per l'amplificazione specifica del gene CHD-W nei pappagalli. Per altri prodotti, Si prega di consultare il produttore.
4. Questo prodotto è solo per uso singolo. Non congelare ripetutamente e scongelare. È solo a scopo di ricerca scientifica e non dovrebbe essere utilizzato per la diagnosi clinica o altri scopi.