Apa prinsip dan tujuan elektroforesis DNA? Cara menggunakannya?

Elektroforesis DNA adalah teknik laboratorium umum yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Hal ini memungkinkan peneliti untuk memvisualisasikan, mengenali, dan memurnikan sampel DNA berdasarkan berat molekulnya.

Memahami prinsip di balik teknik ini, aplikasi utamanya, dan penggunaan yang tepat sangat penting bagi siapa pun yang bekerja dengan analisis DNA dalam biologi molekuler, forensik, diagnostik klinis, dan banyak lagi. Panduan ini akan memberikan gambaran komprehensif tentang elektroforesis DNA.

Apa Prinsip Dibalik Elektroforesis DNA?

Pemisahan fragmen DNA dengan elektroforesis didasarkan pada migrasi molekul DNA bermuatan negatif melalui matriks gel agarosa di bawah pengaruh medan listrik..

Prinsip utamanya adalah:

• Molekul DNA memiliki muatan negatif yang seragam karena tulang punggung fosfatnya. Ini berarti rasio muatan terhadap massanya konstan.
• Ketika arus listrik dialirkan, molekul DNA yang bermuatan negatif akan tertarik ke arah elektroda positif.
• Gel agarosa memberikan efek penyaringan yang menyebabkan fragmen DNA yang lebih kecil bermigrasi lebih cepat dibandingkan fragmen DNA yang lebih besar.
• Karena itu, seiring berjalannya waktu, Fragmen DNA dipisahkan berdasarkan ukurannya, dengan fragmen yang lebih kecil lebih dekat ke elektroda positif dibandingkan dengan yang lebih besar.

Bagaimana Cara Kerja Gel Agarosa?

Gel agarosa terdiri dari polimer agarosa yang diekstraksi dari rumput laut. Ketika bubuk agarosa dilarutkan dalam buffer dan dibiarkan mengeras, itu membentuk gel yang mengandung pori-pori kecil.

Ciri-ciri gel agarosa antara lain:

• Konsentrasi agarosa menentukan ukuran pori. Persentase yang lebih tinggi membuat pori-pori lebih kecil.
• Ukuran pori yang lebih kecil memperlambat migrasi tetapi memberikan pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil. Pori-pori yang lebih besar memungkinkan migrasi lebih cepat tetapi resolusi lebih rendah.
• Gel direndam dalam buffer konduktif yang mempertahankan pH konstan selama elektroforesis. Buffer yang umum adalah TAE dan TBE.
• Pewarna interkalasi seperti etidium bromida ditambahkan. Pewarna ini menyisipkan di antara basa DNA dan memungkinkan visualisasi pita DNA di bawah sinar UV.

Apa yang Dibutuhkan untuk Menjalankan Elektroforesis DNA?

Itu peralatan dasar dan bahan untuk elektroforesis gel agarosa adalah:

• Gel agarosa –Khas 0.5-2% konsentrasi agarosa. Persentase lebih tinggi untuk pemisahan fragmen kecil yang lebih baik.
• Baki gel dan sisir– Untuk menuang gel dengan sumur sampel.
• Tangki elektroforesis– Menampung gel dan buffer. Berisi elektroda untuk mengalirkan arus.
• Catu daya –Menerapkan arus listrik konstan, biasanya 50-150V.
• Penyangga – Umumnya TAE atau TBE untuk merendam gel. Menghantarkan arus.
• Memuat pewarna– Mengandung gliserol dan bromofenol biru untuk menambah kepadatan dan warna pada sampel DNA sebelum dimasukkan ke dalam sumur.
• Tangga DNA– Penanda berat molekul yang mengandung fragmen DNA dengan ukuran yang diketahui. Digunakan untuk mengidentifikasi ukuran pita sampel.
• Pewarnaan pewarna – Etidium bromida atau alternatif untuk memvisualisasikan pita DNA di bawah sinar UV.

Apa Langkah Kunci dalam Elektroforesis DNA?

Langkah-langkah kunci dalam elektroforesis DNA adalah sebagai berikut:

1. Buat gel agarosa dengan ukuran pori yang diinginkan dan masukkan ke dalam baki gel.
2. Tambahkan pewarna pewarna ke gel.
3. Masukkan tangga DNA dan sampel yang dicampur dengan pewarna pemuatan ke dalam sumur.
4. Rendam gel dalam buffer elektroforesis di dalam tangki.
5. Pasang elektroda dan berikan arus untuk menjalankan gel.
6. Matikan arus listrik setelah bagian depan pewarna telah berpindah pada jarak yang sesuai.
7. Visualisasikan pita DNA di bawah sinar UV dan fotolah untuk dianalisis.
8. Bandingkan ukuran pita dengan tangga DNA untuk menentukan panjang fragmen.
9. Potong pita DNA dari gel untuk aplikasi hilir jika diperlukan.

Apa Aplikasi Utama Elektroforesis DNA?

Ada banyak kegunaan penting elektroforesis DNA dalam penelitian, diagnosis klinis, forensik, dan bioteknologi:

• Konfirmasikan keberhasilan ekstraksi DNA atau PCR amplifikasi dengan memvisualisasikan keberadaan dan kuantitas DNA.
• Periksa ukuran fragmen DNA setelah PCR, kloning, atau pembatasan intisari.
• Bandingkan profil DNA untuk pengujian identitas dalam forensik.
• Mendeteksi penyisipan gen, penghapusan, atau mutasi yang terkait dengan kelainan genetik.
• Pisahkan dan murnikan fragmen DNA dengan ukuran tertentu, misalnya. untuk kloning.
• Hitung jumlah relatif DNA antar sampel berdasarkan intensitas pita.
• Periksa degradasi DNA atau kontaminan dari pita yang tersebar atau banyak.
• Mempersiapkan DNA untuk diurutkan, Noda selatan, atau tes pergeseran mobilitas elektroforesis.

Apa Saja Pertimbangan Utama Saat Menjalankan Gel DNA?

Berikut adalah beberapa pertimbangan utama yang harus diingat saat menjalankan gel DNA:

• Pilih konsentrasi agarosa yang sesuai dengan ukuran fragmen yang diharapkan.
• Sertakan tangga DNA di setidaknya satu jalur untuk memungkinkan identifikasi ukuran pita.
• Campur sampel secara menyeluruh dengan pewarna pemuatan sebelum memasukkan sumur.
• Hindari membebani sumur sampel dengan terlalu banyak DNA.
• Jalankan gel pada voltase yang sesuai – voltase yang lebih tinggi dapat menyebabkan distorsi pita.
• Hentikan elektroforesis setelah bagian depan pewarna telah berpindah pada jarak yang cukup.
• Kenakan pelindung saat memvisualisasikan DNA dengan sinar UV.
• Foto gel dengan cepat sebelum pita menyebar terlalu banyak.
• Saat memotong pita DNA, gunakan pisau bedah bersih pada baki UV untuk setiap fragmen.

Kesimpulan

Jadi, Elektroforesis DNA adalah teknik penting yang menggunakan migrasi molekul DNA bermuatan melalui matriks gel agarosa di bawah arus listrik untuk memisahkan fragmen berdasarkan ukurannya.. Aplikasi utama termasuk memvisualisasikan produk PCR, menganalisis DNA genom, dan pemurnian preparatif fragmen DNA. Prinsip dan detail teknis harus diperhatikan secara cermat saat melakukan elektroforesis untuk mendapatkan hasil yang optimal. Dengan latihan, Elektroforesis DNA menjadi teknik pekerja keras yang andal bagi banyak laboratorium biologi molekuler.

FAQ

Mengapa elektroforesis memisahkan DNA berdasarkan ukurannya?

Meski memiliki kepadatan muatan yang sama, efek pengayakan pori-pori gel agarosa menyebabkan gesekan DNA sebanding dengan ukurannya – fragmen yang lebih kecil menemui hambatan yang lebih kecil. Hal ini menghasilkan pemisahan berdasarkan ukuran.

Seberapa akurat memperkirakan ukuran fragmen dari tangga DNA?

Perbandingan dengan tangga akan memberikan perkiraan ukuran pita, biasanya di dalam 10% ketepatan. Pengukuran yang lebih tepat memerlukan Analisis Fragmen khusus.

Mengapa tangga dijalankan dengan gel yang sama dengan sampel?

Menjalankan tangga DNA bersama sampel memungkinkan Anda memvisualisasikan migrasi dalam gel spesifik tersebut dan memperhitungkan segala distorsi migrasi dalam pita.

Bisakah Anda mengukur jumlah DNA langsung dari intensitas pita?

Sementara intensitas relatif memberikan perkiraan, kuantifikasi DNA yang akurat memerlukan instrumen khusus seperti spektrofotometer atau fluorometer.

Mengapa renyah, pita bening yang penting dalam elektroforesis DNA?

Pita DNA yang tajam menunjukkan utuh, fragmen DNA murni. Pita atau noda yang menyebar menunjukkan DNA terdegradasi atau kontaminan seperti sisa primer atau garam yang mengganggu.

Bisakah elektroforesis memisahkan DNA berdasarkan urutannya?

TIDAK, elektroforesis gel agarosa hanya dipisahkan berdasarkan ukurannya. Namun, teknik khusus seperti DGGE juga dapat memisahkan berdasarkan perbedaan urutan kecil.