Proteinase K adalah penting enzim Digunakan dalam laboratorium biologi molekuler untuk mencerna dan menghilangkan protein dari persiapan asam nukleat. Enzim proteolitik ini memiliki sifat utama yang membuatnya sangat berguna untuk aplikasi penelitian. Di posting ini, Kami akan mengeksplorasi apa sebenarnya Proteinase K, bagaimana fungsinya, dan banyak kegunaan di lab.
Apa itu Proteinase K??
Proteinase K adalah protease serin spektrum luas yang diisolasi dari album jamur tritirachium. Ini dapat dengan cepat mencerna protein menjadi fragmen peptida yang lebih kecil dan asam amino.
Namanya “proteinase k” berasal dari kemampuannya untuk mencerna keratin, protein struktural yang sulit ditemukan di rambut, kuku, bulu, dll.. Album Fungus Tritirachium Secretes Proteinase K Saat keratin disediakan sebagai satu -satunya sumber nitrogennya.
Apa fakta tentang proteinase k?
Beberapa fakta utama tentang proteinase k:
- Klasifikasi: Milik keluarga peptidase S8 (Keluarga Subtilisin)
- Tipe katalitik: Protease serin
- PH optimal:5 – 12.0
- Suhu optimal:50°C – 65°C
- Berat molekul:28,930 Dan
Proteinase K mengandung triad katalitik dari tiga asam amino – aspartat, histidin, dan serin. Serin bertindak sebagai nukleofil yang membelah ikatan peptida. Ion kalsium penting untuk aktivitas enzimatik penuh.
Bagaimana cara kerja proteinase k?
Sebagai protease serin, Proteinase K mengkatalisasi hidrolisis ikatan peptida yang berdekatan dengan gugus karboksilat asam amino alifatik dan aromatik.
Mekanisme aksinya menyerupai protease serin lainnya seperti chymotrypsin dan trypsin. Inilah langkah -langkah kuncinya:
- Serin katalitik enzim memulai serangan nukleofilik pada ikatan peptida karbon karbon.
- Ini membentuk perantara tetrahedral yang distabilkan oleh ikatan hidrogen.
- Ikatan nitrogen-karbon kemudian pecah, Melepaskan produk pertama dan membentuk perantara asil-enzim.
- Molekul air menonaktifkan enzim, merilis produk kedua.
- Ini meregenerasi situs serin aktif untuk putaran katalisis lain.
Proteinase K membelah protein pada ikatan peptida interior sebagai endopeptidase. Itu tidak memiliki spesifisitas yang ketat tetapi lebih suka residu hidrofobik yang besar. Ini memungkinkannya untuk dengan cepat memecah sebagian besar protein menjadi fragmen yang lebih kecil.
Untuk apa proteinase K digunakan?
Proteinase K telah menjadi reagen penting untuk penelitian biologi molekuler. Berikut adalah beberapa kegunaannya yang paling umum:
Mencerna protein kontaminasi
Saat mengisolasi DNA atau RNA dari sel dan jaringan, Proteinase K digunakan untuk mencerna protein yang terkontaminasi. Ini menghilangkan kotoran dari persiapan asam nukleat. Menambahkan deterjen seperti SDS membantu mengekspos protein untuk pencernaan yang ditingkatkan.
Tidak aktif nuklease
Banyak nuklease yang dapat menurunkan DNA dan RNA adalah protein itu sendiri. Proteinase K dengan cepat menonaktifkan nuklease berbahaya ini dengan pembelahan proteolitik. Ini melindungi asam nukleat yang terisolasi dari degradasi.
Pencernaan jaringan
Proteinase K dapat membantu memisahkan sel dan melarutkan jaringan, melepaskan asam nukleat untuk ekstraksi. Ini termasuk dalam buffer lisis jaringan untuk protokol pemurnian DNA/RNA.
Analisis Protein
Protease menghasilkan fragmen peptida spesifik yang memberikan informasi tentang struktur protein. Pola pencernaan proteinase K berguna untuk mempelajari domain protein, situs modifikasi, dll..
Menonaktifkan prion infeksius
Sebagai endopeptidase, Proteinase K dapat mencerna protein prion yang salah lipatan yang bertanggung jawab untuk ensefalopati spongiform yang dapat ditularkan seperti penyakit creutzfeldt-jakob. Itu digunakan untuk menonaktifkan kontaminasi prion.
Sequencing DNA
Beberapa metode sekuensing DNA menggunakan proteinase K untuk menghilangkan DNA polimerase setelah ekstensi urutan, Mempersiapkan DNA untuk elektroforesis.
Hibridisasi in situ
Enzim dapat dengan lembut permeabilisasi sel/jaringan tetap untuk hibridisasi probe nukleotida sambil menjaga integritas RNA dan DNA.
Kondisi apa yang dibutuhkan proteinase K?
Berikut ini adalah kondisi yang dibutuhkan proteinase K untuk berfungsi dengan baik.
Suhu
Proteinase K menunjukkan aktivitas tinggi dari 50 ° C hingga 65 ° C, dengan suhu optimal sekitar 60 ° C. Itu mempertahankan beberapa kemampuan proteolitik bahkan pada suhu 37 ° C. Suhu yang lebih tinggi kemungkinan membuat struktur protein lebih mudah diakses.
pH
Enzim ini berfungsi di atas kisaran pH yang luas dari pH 4 ke ph 12, dengan aktivitas maksimal antara pH 7.5 Dan 12. Kondisi alkali adalah yang terbaik, Tapi pH netral juga bekerja dengan baik.
Deterjen
Menambahkan deterjen ionik seperti SDS (Sodium dodecyl sulfat) dapat meningkatkan aktivitas proteinase K dengan mendenaturasi substrat protein. Deterjen non-ionik suka Triton X-100 juga bekerja.
Kation divalen
Proteinase K membutuhkan ion kalsium untuk aktivitas dan stabilitas enzimatik penuh. EDTA Chelates kalsium dan dapat menghambat enzim. Namun, Proteinase K masih mempertahankan beberapa fungsi tanpa kalsium.
Bagaimana proteinase K digunakan di lab?
Proteinase K memiliki fungsi penting di laboratorium dan digunakan di lab dengan cara berikut:
Resep buffer proteinase k
Buffer pencernaan proteinase K yang khas:
- 10 mm Tris-HCl pH 8.0
- 100 MM NaCl
- 5% SDS
- 50 μg/mL proteinase k
Tris mempertahankan pH alkali di sekitar 8.0. NaCl memberikan kekuatan ionik. SDS mendenaturasi protein untuk pencernaan. Buffer dapat dimodifikasi sesuai kebutuhan.
Protokol Pencernaan
- Tambahkan proteinase K ke buffer sebelum digunakan.
- Inkubasi sampel dalam buffer untuk 30 min to 2 jam pada 50 ° C hingga 65 ° C.
- Menonaktifkan proteinase K dengan pemanasan pada 95 ° C untuk 10 min atau menggunakan pmsf.
Pencernaan yang lebih lama atau suhu yang lebih tinggi dapat meningkatkan aktivitas. Konteks sampel menentukan kondisi optimal.
Peringatan!
Proteinase K adalah protease yang sangat kuat. Perawatan harus diambil untuk menghindari sampel yang terkontaminasi atau protein yang merendahkan yang dimaksudkan untuk dianalisis. Selalu kenakan sarung tangan dan gunakan persediaan khusus.
Bagaimana proteinase k tidak aktif?
Setelah Proteinase K telah melayani tujuannya, itu harus dinonaktifkan untuk menghentikan pencernaan lebih lanjut. Berikut beberapa metode:
- Pemanas: Suhu di atas 90 ° C dengan cepat menonaktifkan enzim. Namun, Pemanasan tidak sepenuhnya menghilangkan aktivitas residu.
- PMSF: Inhibitor protease serin yang ireversibel ini secara kovalen memodifikasi serin katalitik, aktivitas pemblokiran secara permanen.
- Aebsf: Inhibitor protease serin lain yang secara permanen menonaktifkan proteinase k.
- TCA: Denature asam trichloroacetic dan mengendapkan enzim.
Pemanasan adalah metode yang paling nyaman, Tetapi inhibitor protease serine memberikan inaktivasi total.
Apa saja alternatif proteinase k?
Beberapa alternatif proteinase k termasuk:
- Pronase: Campuran protease yang tidak spesifik yang diisolasi dari Streptomyces griseus.
- Trypsin: Protease serin dengan spesifisitas untuk lisin dan arginin.
- Pepsin: Protease aspartika dari jus lambung mamalia. Bekerja paling baik dalam kondisi asam.
- Papain: Protease sistein dari pepaya. Sering digunakan untuk disosiasi sel.
Masing -masing memiliki beberapa tumpang tindih dengan proteinase K dalam protein yang merendahkan, tetapi sifat spesifiknya berbeda. Proteinase K masih merupakan yang paling banyak digunakan untuk keperluan lab umum.
Kesimpulan
Proteinase proteinase serin yang kuat sangat diperlukan untuk penelitian biologi molekuler dan diagnostik. Kemampuannya yang luar biasa untuk mencerna protein dengan cepat sambil tetap aktif dalam kondisi yang keras menjadikannya enzim masuk untuk menghilangkan protein kontaminasi dan melindungi asam nukleat.
Memahami apa proteinase k, bagaimana fungsinya, dan kondisi kerjanya yang optimal memungkinkan para peneliti untuk memanfaatkan potensi penuhnya di lab. Protease serbaguna ini terus memungkinkan teknik yang tak terhitung jumlahnya dengan menghilangkan protein yang mengganggu dan menonaktifkan nuklease berbahaya untuk memulihkan DNA dan RNA dari kemurnian tertinggi.
