Kit Ekstraksi RNA Super-Pure (Trizol)

1. Komponen kit reagen

Spesifikasi	50T	100T
Kucing. TIDAK.	SN0303	SN0304
Kolom ekstraksi RNA (mengatur)	50 (mengatur)	100 (mengatur)
DNase I	1ml	1ml
10 × buffer reaksi	1 ml	2 × 1ml
Buffer Trizol	50 ml	2 × 50 ml
Buffer penghapusan inhibitor	30 ml	2 × 30 ml
Cuci Buffer 1	15 ml	2 × 15 ml
Penyangga Elusi	20 ml	2 × 20 ml
Instruksi manual	1	1

 

2. Penyimpanan

Kit reagen ini harus disimpan pada suhu kamar (15-25℃) di lingkungan yang kering dan stabil untuk 12 bulan. DNase I berisi pengawet, memungkinkan transportasi pada suhu kamar, tapi untuk penyimpanan jangka panjang, itu harus dijaga pada -20℃.

3. Petunjuk Penggunaan Kit Reagen

3.1 Kit ini ditujukan untuk tujuan penelitian biologi molekuler dan tidak boleh digunakan untuk diagnosis atau pengobatan penyakit.

3.2 Beberapa komponen dalam kit mengandung bahan pengiritasi; disarankan untuk mengambil tindakan pencegahan yang diperlukan (seperti memakai pakaian pelindung dan kacamata).

3.3 Penggunaan kit ini memerlukan peralatan tambahan seperti centrifuge berkecepatan tinggi, mandi air (mandi logam), pencampur pusaran, etanol anhidrat, nitrogen cair, khloroform, air deionisasi steril, dan tabung EP.

4. Pengantar Kit Reagen

Kit pemurnian RNA ini menggunakan trizol tradisional yang dikombinasikan dengan metode membran kolom untuk pemurnian tanaman yang cepat, hewan, jaringan, sel, RNA mikroba, dan RNA hifa jamur. Itu cocok untuk sebagian besar spesies. Kit pemurnian RNA ini dapat diterapkan pada jaringan tanaman yang melebihi 100 mg. RNA yang diekstraksi dengan kit ini memiliki kandungan DNA yang sangat rendah. Jika sensitivitas terhadap DNA dalam percobaan menjadi perhatian, disarankan untuk menggunakan pencernaan DNase I pada kolom.

Kit Pemurnian Cepat RNA dapat mengekstraksi RNA total dari sampel (termasuk RNA nuklir dan RNA sitoplasma) di dalam 1 jam. RNA yang diekstraksi dapat langsung digunakan untuk RT-PCR, Northern blotting, dan aplikasi lainnya.

5. Prinsip dan Prosedur Eksperimental

6. Proses Ekstraksi

Tindakan pencegahan sebelum memulai percobaan:

A. Sebelum digunakan, Tambahkan jumlah etanol absolut yang ditentukan MencuciPenyangga 1 Menurut label pada botol reagen, dan centang kotak pada label untuk menunjukkan bahwa etanol absolut telah ditambahkan.

B. Buffer Elusi adalah a 0.1x solusi TE mengandung minimal EDTA. Jika EDTA mempengaruhi percobaan selanjutnya, disarankan untuk mengganti buffer elusi dengan air deionisasi steril.

1. Pemrosesan Sampel:

A. Jaringan: Jika bahan segar tidak dapat digunakan segera, Tempatkan mereka dalam nitrogen cair dan simpan di -80 ° C. Bahan kering dapat disimpan pada suhu kamar. Menggiling 30 ~ 80 mg jaringan dalam nitrogen cair dan tambahkan 1 ML TRIZOL Buffer untuk homogenisasi.

B. Sel kultur monolayer: Aspirasi media budaya dan tambahkan 1 ML TRIZOL Buffer untuk homogenisasi.

C. Suspensi sel: Centrifuge untuk mengumpulkan sel dan menambahkan 1 ML TRIZOL Buffer untuk homogenisasi.

2. Setelah menambahkan Buffer Trizol ke sampel, Campur dengan teliti dengan pipetting, Izinkan lisis sampel lengkap, dan inkubasi pada suhu kamar selama 5 menit.

3. Tambahkan kloroform dalam rasio 200 μl per 1 ML Buffer Trizol, goyang dengan kuat untuk 30 detik, dan inkubasi pada suhu kamar selama 2 menit.

4. Centrifuge lisat pada suhu 4 ° C, 12,000 rpm untuk 10 menit. RNA akan hadir dalam fase air atas.

5. Pindahkan supernatan dengan hati-hati ke dalam tabung sentrifugasi baru, menghindari koleksi lapisan tengah dan bawah. (Catatan: Sekitar 400 μl cairan dapat ditransfer, yang mungkin kurang untuk beberapa spesies.)

6. Tambahkan volume yang sama dari etanol absolut yang sudah dingin, aduk dengan cepat. (Misalnya, menambahkan 400 μl lisat, menambahkan 400 μl etanol absolut. Jika volume lisat kurang dari 400 μl, Kurangi jumlah etanol absolut secara proporsional. Sedikit endapan dapat terbentuk setelah menambahkan etanol, tetapi tidak mempengaruhi percobaan selanjutnya.)

7. Pindahkan cairan yang diperoleh ke kolom pemurnian RNA (sekitar 650-700 μl per waktu), centrifuge lebih dari 8,000 rpm untuk 1 menit, membuang sampah yang dikumpulkan, dan masukkan kembali tabung pengumpul ke dalam kolom pemurnian untuk langkah selanjutnya.

8. Ulangi langkah 7, Menambahkan cairan yang tersisa ke kolom pemurnian RNA, centrifuge lebih dari 8,000 rpm untuk 1 menit, Buang limbah dan tabung pengumpulan.

9. Tempatkan kolom pemurnian RNA di tabung koleksi baru, menambahkan 300 μl buffer penghapusan inhibitor, centrifuge lebih dari 8,000 rpm untuk 1 menit, membuang limbahnya, dan memasukkan kembali kolom pemurnian RNA ke dalam tabung untuk langkah berikutnya.

10. Menambahkan 80 μl DNase ISolusi berfungsi untuk kolom pemurnian RNA, Inkubasi pada 20 ° C hingga 30 ° C untuk 15 menit. (Persiapkan solusi kerja DNase I: 62 μl air bebas rnase, 8 μl 10 × buffer reaksi, Dan 10 μl dnase i, membuat 80 Solusi kerja μl dnase I.)

11. Menambahkan 300 μl buffer penghapusan inhibitorke kolom pemurnian RNA, centrifuge lebih dari 8,000 rpm untuk 1 menit, membuang limbahnya, dan memasukkan kembali kolom pemurnian RNA ke dalam tabung untuk langkah berikutnya.

12. Menambahkan 700 μl Buffer Cuci 1ke kolom pemurnian RNA, sentrifugasi di 14,000 rpm (20,000×g) untuk 2 menit, Perpanjang waktu sentrifugasi jika diperlukan untuk membran yang lebih kering. (Catatan: Konfirmasikan penambahan etanol ke buffer cuci 1; Kehadiran etanol secara signifikan mempengaruhi percobaan selanjutnya. Pastikan membran kering setelah sentrifugasi sebelum elusi. Buang sampah dan tabung pengumpul. Setelah menggunakan buffer cuci 1, Membran pada kolom pemurnian RNA hanya boleh memiliki sedikit warna. Lepaskan kolom pemurnian RNA dengan hati -hati setelah sentrifugasi, memastikan tidak menyentuh tabung koleksi untuk menghindari kontaminasi etanol.)

13. Tempatkan kolom pemurnian RNA dalam tabung centrifuge baru, menetes 100 μl Buffer Elusike membran, Inkubasi pada suhu kamar untuk 5 menit (15° C hingga 25 ° C.), dan centrifuge di lebih dari 8,000 rpm untuk 1 menit. (Catatan: Mengelusi RNA dengan 50 μl buffer elusi dapat meningkatkan konsentrasi RNA tetapi mengurangi hasil RNA total.)

14. Ulangi langkah sebelumnya. (Catatan: Tabung centrifuge baru dapat digunakan untuk mengumpulkan RNA dielusi untuk kedua kalinya atau melanjutkan menggunakan tabung koleksi asli untuk mengumpulkan RNA.)